Veränderungen der roten Blutkörperchen von Höhlenfischen sind Hinweise auf eine Anpassung an den reduzierten Sauerstoffgehalt im Untergrund

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 3735 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Tiere, die in extremen Umgebungen leben, bieten die großartige Gelegenheit, die adaptive Evolution als Reaktion auf verschiedene Belastungen zu untersuchen. Ein solcher Druck ist reduzierter Sauerstoff, der üblicherweise in großer Höhe und in unterirdischen Umgebungen vorhanden ist. Höhlentiere müssen auch mit Dunkelheit und Hunger zurechtkommen, die beide als Schlüsselfaktoren für die Entwicklung höhlenassoziierter Merkmale eingehend untersucht wurden. Interessanterweise wurde Hypoxie als Umweltbelastung weniger Beachtung geschenkt. Hier untersuchten wir mutmaßlich adaptive Phänotypen, die sich in einem Süßwasserknochenfisch, Astyanax mexicanus, entwickeln, der sowohl an der Oberfläche als auch in Höhlen lebende Formen umfasst. Dieses Modellsystem bietet aufgrund des Vorhandenseins zahlreicher natürlicher und unabhängig besiedelter Höhlenpopulationen sowie eng verwandter Oberflächenartgenossen auch die Möglichkeit, konvergente Reaktionen auf Hypoxie zu identifizieren. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf Hämoglobin, einem essentiellen Molekül für den Sauerstofftransport und die Sauerstoffabgabe. Wir fanden heraus, dass mehrere Höhlenpopulationen eine höhere Konzentration an Hämoglobin in ihrem Blut aufweisen, was mit einer Zunahme der Größe höhlenmorpher Erythrozyten im Vergleich zu Oberflächenfischen einhergeht. Interessanterweise weisen sowohl Höhlen- als auch Oberflächenmorphs eine vergleichbare Anzahl an Erythrozyten pro Bluteinheit auf, was darauf hindeutet, dass ein erhöhter Hämoglobinwert nicht auf eine Überproduktion roter Blutkörperchen zurückzuführen ist. Alternativ gehen wir aufgrund der größeren Zellfläche der Erythrozyten bei Höhlenfischen davon aus, dass sie mehr Hämoglobin pro Erythrozyten enthalten. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass Höhlenfische sich durch Modulation sowohl der Hämoglobinproduktion als auch der Erythrozytengröße an die Hypoxie in Höhlen angepasst haben. Diese Arbeit enthüllt ein zusätzliches adaptives Merkmal des Astyanax-Höhlenfisches und zeigt, dass koordinierte Veränderungen zwischen Zellarchitektur und molekularen Veränderungen für Organismen notwendig sind, die sich unter starkem Umweltdruck entwickeln.

Unser Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen extremen Umweltbedingungen und der Reaktion des Organismus auf diese Belastungen ist noch unvollständig. Ein leistungsstarkes natürliches Modell zur Untersuchung der Anpassung in extremen Umgebungen ist der blinde mexikanische Höhlenfisch Astyanax mexicanus (Abb. 1a). Diese Art ermöglicht einen direkten Vergleich zweier vorhandener Morphotypen, eines flussbewohnenden „Oberflächen“-Morphs und obligater unterirdischer „Höhlen“-Morphs. Dreißig erhaltene Höhlenpopulationen1 sind über Netzwerke unterirdischer Höhlen im freigelegten Kalksteinkarst der Region Sierra de El Abra im Nordosten Mexikos verteilt (Abb. 1a). Phänotypische Veränderungen begleiteten diesen Übergang von der Oberfläche zur Höhle über einen geschätzten Zeitraum von etwa 20.000 bis 500.000 Jahren2,3, einschließlich Augenverlust, Pigmentierung und Verbesserung der nicht-visuellen Sinne. In den acht Jahrzehnten seit ihrer Entdeckung4 wurden erhebliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die den regressiven Merkmalen zugrunde liegen. Die Umweltbelastungen des Karstsystems El Abra haben jedoch hauptsächlich die Auswirkungen von begrenztem Licht und begrenzter Ernährung untersucht5.

Mehrere Populationen des Höhlenfischs Astyanax mexicanus weisen im Vergleich zu Oberflächenfischen höhere Hämoglobinkonzentrationen auf. Astyanax mexicanus besteht aus Höhlen- und Oberflächenmorphotypen. Die Höhlenmorphs sind über zahlreiche Höhlen der Sierra de El Abra im Nordosten Mexikos verteilt, während Oberflächenmorphs in nahegelegenen Flüssen, Bächen und Seen vorkommen (a). Jede der drei Cavefish-Populationen wies statistisch signifikant höhere Hämoglobinkonzentrationen auf als die konspezifischen Oberflächenmorphe (b, Chica WRS p = 0,005, Tinaja WRS p = 0,0005, Pachón WRS p = 0,0001). Die Hämoglobinkonzentrationen wurden mittels spektrophotometrischer Analyse gemessen (c). Es wurden keine Ausreißer festgestellt.

Ein in unterirdischen Höhlen häufig auftretender Umweltdruck, der verringerte Sauerstoffgehalt, hat weitaus weniger Beachtung gefunden. Unterirdische Umgebungen auf der ganzen Welt weisen im Vergleich zu umgebenden terrestrischen Umgebungen aufgrund der Atmung von Organismen6, dem Fehlen von Photosyntheseeinträgen6 und der begrenzten Luftvermischung mit der Oberflächenatmosphäre7 häufig einen geringeren Sauerstoffgehalt auf. Empirische Messungen des gelösten Sauerstoffs wurden in zwei El Abra-Höhlen, Pachón und Tinaja, durchgeführt, die deutlich niedrigere Sauerstoffwerte in Höhlenbecken im Vergleich zu umgebenden Oberflächengewässern zeigten (DO = 2,97 mg/L in der Pachón-Höhle im Vergleich zu 8,20 mg/L in der Oberflächenumgebung (Rascón); 59 % Sättigung in der Tinaja-Höhle im Vergleich zu 80 % Sättigung in der Oberflächenumgebung (Nacimiento del Río Choy)8,9. Obwohl dieses Umweltmerkmal höchstwahrscheinlich die Entwicklung des Astyanax-Höhlenfischs beeinflusst hat, gibt es nur wenige Studien dazu befasste sich mit den mutmaßlichen adaptiven Merkmalen, die diesen Druck abmildern10,11,12.

Aufgrund der globalen Auswirkungen des Klimawandels13,14,15 und der daraus resultierenden Auswirkungen auf den natürlichen Gehalt an gelöstem Sauerstoff wurde die Hypoxietoleranz bei mehreren Knochenfischarten untersucht. Zu den komplexen Reaktionen auf Hypoxie gehören Verhaltensänderungen (verringerte Raubtiervermeidung bei Meeräschen16), morphologische Veränderungen (Kiemenumbau bei Karauschen17) und molekulare Veränderungen (erhöhte Expression des Sauerstoffsensorgens HIF-1 beim Zebrafisch18).

Damit ausreichend Sauerstoff das periphere Gewebe erreicht, nutzen Wirbeltiere Hämoglobinproteine als Sauerstoffträger. Hämoglobinmoleküle umfassen vier Tetramere, von denen jedes ein einzelnes Sauerstoffmolekül bindet, sodass pro Hämoglobinprotein vier Sauerstoffmoleküle geladen sind. Die natürlichen Sauerstoffkonzentrationen können je nach Umgebung erheblich variieren und viele Tiere benötigen präzise Sauerstoffwerte, um ihren normalen Stoffwechsel aufrechtzuerhalten. Daher waren Hämoglobin-Gene und -Proteine wahrscheinlich evolutionären Veränderungen in allen Wirbeltier-Taxa unterworfen19. Dazu gehören numerische Variationen in der genomischen Organisation von Hämoglobin-Genen20, eine Erhöhung der Hämoglobinkonzentration in Tambaqui21 oder eine erhöhte Hämoglobin-Bindungsaffinität in Red Drum22. Hier haben wir die Hämoglobinkonzentration untersucht, da es sich um den primären molekularen Transport für die Sauerstoffversorgung handelt23.

Wir haben Veränderungen bei Höhlenfischen identifiziert, die sich auf die Hämoglobinkonzentration und die Größe der roten Blutkörperchen auswirken und wahrscheinlich an die sauerstoffarme Höhlenumgebung angepasst sind. Diese Veränderungen, die bei eng verwandten Oberflächenmorphen fehlen, verleihen Astyanax-Höhlenfischen wahrscheinlich eine Hypoxietoleranz, da sie über Generationen hinweg unter den gleichen Bedingungen in Gefangenschaft aufgezogen wurden (und bestehen bleiben). Somit bietet dieses Modell die einzigartige Möglichkeit, die genetische Grundlage für Veränderungen des Hämoglobintransports und der Hypoxietoleranz in freier Wildbahn zu identifizieren.

Hämoglobin ist das primäre Sauerstofftransportmolekül in fast allen Wirbeltieren19. Wir kamen zunächst zu dem Schluss, dass der Hämoglobinspiegel in Höhlenmorphen als Anpassung an den verringerten Sauerstoffgehalt in der Höhlenumgebung (im Vergleich zu darüber liegenden terrestrischen Umgebungen6) höher sein könnte, basierend auf direkten Messungen aus den El Abra-Höhlen, in denen Astyanax-Höhlenfische gefunden werden8,9. Ein adaptiver Mechanismus bei niedrigem Sauerstoffgehalt ist die Erhöhung der Hämoglobinkonzentration24,25, um den verfügbaren Sauerstoff für den systemischen Transport zu erhöhen.

Mithilfe eines spektrophotometrischen Ansatzes („Material und Methoden“) stellten wir fest, dass die mittlere Hämoglobinkonzentration in Oberflächenfischen (n = 26) 8,25 ± 0,23 g/dl betrug (Abb. 1b). Alle drei untersuchten Cavefish-Populationen (Chica-, Tinaja- und Pachón-Cavefish) hatten signifikant höhere mittlere Hämoglobinkonzentrationen als Oberflächenfische (Chica n = 8, Mittelwert = 9,86 ± 0,43 g/dl, Wilcoxon Rank-Sum (WRS) p = 0,005; Tinaja n = 8, Mittelwert = 10,60 ± 0,38 g/dL, WRS p = 0,0005; Pachón n = 30, Mittelwert = 10,49 ± 0,39 g/dL, WRS p = 0,0001; Abb. 1b), unterschieden sich jedoch nicht voneinander (Abb . 1b). Vermutlich ermöglichen höhere Hämoglobinkonzentrationen Höhlenmorphen, mit dem begrenzten gelösten Sauerstoff in der Höhle zurechtzukommen. Allerdings könnten verschiedene zelluläre Merkmale möglicherweise zu einer erhöhten Hämoglobinkonzentration beitragen, weshalb wir als nächstes die zellulären Merkmale von Erythrozyten (d. h. roten Blutkörperchen) untersuchten.

Der Hämatokrit ist der Anteil eines bestimmten Blutvolumens, der von Erythrozyten eingenommen wird (Abb. 2a). Bestimmte klinische Phänotypen beim Menschen, z. B. Polyzythämie vera26, werden auf der Grundlage erhöhter Hämatokritwerte diagnostiziert27,28. Daher können höhere Hämoglobinkonzentrationen bei Höhlenfischen auf das Vorhandensein von mehr Erythrozyten im Vergleich zu Oberflächenfischen zurückzuführen sein. Um festzustellen, ob ein erhöhter Hämoglobinwert durch eine Überproduktion roter Blutkörperchen verursacht wird, verglichen wir den Hämatokrit zwischen Oberflächen- und Höhlenmorphen.

Der Hämatokritwert ist bei Höhlenfischen höher als bei Oberflächenfischen. Der Anteil der roten Blutkörperchen am Gesamtblutvolumen (Hämatokrit) wurde durch Zentrifugation von Mikrokapillarröhrchen bestimmt. Die Erythrozytenphase sammelt sich am distalen Ende des Kapillarröhrchens, während sich Buffy Coat und Plasma weiter proximal ansammeln (a). Obwohl beim individuellen Vergleich der Populationen keine statistische Signifikanz erreicht wurde (im Vergleich zur Oberfläche; Chica WRS p = 0,115, Tinaja WRS p = 0,018, Pachón WRS p = 0,161), wurde für jede Höhlenfischpopulation im Vergleich zur Oberfläche ein klarer Trend zu einem höheren Hämatokrit festgestellt (B). Beim Vergleich nach Morphotyp (Oberfläche im Vergleich zu allen Höhlenfischen) weisen Höhlenfische jedoch einen statistisch signifikant höheren mittleren Hämatokrit auf (Oberfläche n = 8, Mittel = 28,51 ± 0,03 %, Höhle n = 24, Mittel = 36,14 ± 0,01 %, WRS p =). 0,024) als Oberflächenfische. Ein Ausreißer (der niedrigste Chica-Wert) wurde entdeckt, obwohl die statistische Signifikanz unverändert blieb (Tabelle S6).

Die Hämatokritwerte waren in jeder von uns untersuchten Höhlenpopulation tendenziell höher als bei Oberflächenfischen (Abb. 2b). Wir führten zunächst einen Vergleich (Wilcoxon-Rank-Sum-Test) zwischen Oberflächenmorphen und Höhlenfischmorphen (unabhängig von einzelnen Höhlenfischlokalitäten) durch, der signifikante Unterschiede zwischen diesen Gruppen ergab (Oberfläche n = 8, Mittelwert = 28,51 ± 0,03 %, Höhle n = 24, Mittelwert). = 36,14 ± 0,01 %, WRS p = 0,024). Anschließend führten wir eine Post-hoc-Analyse durch, in der wir jede der vier Populationen miteinander verglichen. Diese Ergebnisse zeigten eindeutig den gleichen Trend, erreichten jedoch nach der Bonferroni-Korrektur keine statistische Signifikanz (im Vergleich zur Oberfläche; Chica WRS p = 0,115, Tinaja WRS p = 0,018, Pachón WRS p = 0,161, aufgrund der Bonferroni-Korrektur müssen p-Werte sein). < 0,0083, um statistische Signifikanz zu erreichen). Der einheitlich erhöhte Hämatokrit bei Höhlenfischen war jedoch nicht überraschend, da Höhlenfische höhere Hämoglobinkonzentrationen aufweisen. In Übereinstimmung mit den Hämoglobinmessungen wies die Tinaja-Höhlenpopulation den höchsten Hämatokritwert auf (mittlerer Hämatokrit = 39,23 ± 0,03 %, Abb. 2b), gefolgt von der Pachón-Höhle (mittlerer Hämatokrit = 35,56 ± 0,03 %, Abb. 2b) mit der Chica Höhlenpopulation mit dem niedrigsten Hämatokrit (mittlerer Hämatokrit = 33,63 ± 0,01 %, Abb. 2b) der Höhlenpopulationen. Angesichts dieser Ergebnisse untersuchten wir als nächstes die numerische Variation der roten Blutkörperchen für jede Population.

Wir gingen davon aus, dass Höhlenfischpopulationen möglicherweise eine höhere Dichte an Erythrozyten aufweisen als Oberflächenfische, was auf höhere Hämoglobinkonzentrationen und Hämatokritwerte zurückzuführen ist. Unerwarteterweise hatten Oberflächenfische die höchste Dichte an Erythrozyten (n = 8, mittlere Dichte = 2,1 × 106 ± 1,4 × 105/mm3, Abb. 3c-c′), dicht gefolgt von Pachón-Cavefish (n = 8, mittlere Dichte = 2,0 ×). 106 ± 8,2 × 105/mm3, Abb. 3f-f′). Interessanterweise hatten die Höhlenfische Tinaja und Chica etwas geringere mittlere Dichten (n = 8, 1,6 × 106 ± 1,8 × 105/mm3 und n = 8, 1,5 × 106 ± 6,7 × 104/mm3, Abb. 3d–e′). Obwohl sich Chica statistisch von Pachón unterschied (WRS p = 0,001, Abb. 3b), wurden diese Individuen als Erwachsene kommerziell erworben („Material und Methoden“) und daher ist ihr genaues Alter unbekannt. Insgesamt waren die Erythrozytendichten über Oberflächen- und Höhlenmorphologien hinweg vergleichbar, was angesichts der höheren Hämoglobinkonzentrationen und Hämatokritwerte in den Höhlenpopulationen nicht zu erwarten war. Da die Erythrozytendichte bei Höhlenfischen im Allgemeinen verringert war, überlegten wir, ob Unterschiede in der Erythrozytenzellgröße die höhere Hämoglobinkonzentration in Höhlenmorphen erklären könnten.

Die Erythrozytendichte ist bei allen Astyanax-Morphotypen vergleichbar. Wir haben die Dichte der Erythrozyten in einem Standardblutvolumen mit einem Hämozytometer bestimmt (a). Obwohl für die Chica-Population ein statistischer Unterschied festgestellt wurde (p < 0,0023), war die mittlere Erythrozytendichte bei allen Morphotypen vergleichbar (b). Erythrozyten wurden mit Acridinorange gefärbt, unter Lichtmikroskopie sichtbar gemacht (c–f) und mit ImageJ29 (v2.0.0) gezählt (c′–f′, Maßstab 130 µm). Es wurden zwei Ausreißer festgestellt (der niedrigste Wert an der Oberfläche und der höchste in Chica). Die Entfernung dieser Ausreißer führte zu einem statistisch signifikanten Unterschied zwischen Chica und Surface (Tabelle S6).

Wir haben die zweidimensionale Erythrozytenfläche in Standardblutvolumina gemessen, um festzustellen, ob die Größe der roten Blutkörperchen zwischen Höhlen- und Oberflächenpopulationen variiert. Blutausstriche wurden gesammelt, gefärbt und mittels Lichtmikroskopie analysiert. Erythrozyten wurden eindeutig identifiziert („Material und Methoden“), manuell in Pixeleinheiten bewertet (ImageJ29 v2.0.0) und zum direkten Vergleich in µm umgerechnet. Da Höhlenfische erhöhte Hämatokrit- und Hämoglobinwerte, aber vergleichbare Erythrozytendichten aufweisen, gingen wir davon aus, dass jede Höhlenpopulation größere Erythrozytenbereiche aufweisen könnte. Tatsächlich waren die Erythrozyten von Oberflächenfischen in allen Populationen die kleinsten (n = 8, mittlere Fläche = 71,36 ± 1,43 µm2, Abb. 4a), während Erythrozyten aus der Tinaja-Population im Durchschnitt die größten Höhlenpopulationen waren (n = 8, mittlere Fläche). Fläche = 86,05 ± 0,96 µm2, Abb. 4c), gefolgt von Chica (mittlere Fläche = 85,70 ± 1,38 µm2, Abb. 4b) und Pachón Cavefish (mittlere Fläche = 84,06 ± 1,52 µm2, Abb. 4d). Erythrozyten waren bei allen drei Höhlenpopulationen signifikant größer als bei Oberflächenfischen (Chica WRS p = 0,0002, Tinaja WRS p = 0,0002, Pachón WRS p = 0,0006, Abb. 4e). Diese Zellgrößenzunahme ging nicht mit einer Vergrößerung der Kernfläche einher. Bei jeder Population, einschließlich Oberflächenfischen, unterschied sich die zweidimensionale Fläche des Kerns nicht um mehr als 0,5 µm2 (14,9 ± 0,24 µm2, Abb. 4f), was darauf hindeutet, dass Unterschiede in der Erythrozytenfläche auf ein erhöhtes Zellzytoplasma zurückzuführen sind, in dem Hämoglobin gefunden wird.

Die zweidimensionale Oberfläche von Höhlenerythrozyten ist deutlich größer als die von Oberflächenerythrozyten. Erythrozyten aus jeder Population wurden mit Wright-Giemsa angefärbt und unter dem Lichtmikroskop sichtbar gemacht (a–d, Maßstabsbalken 10 µm). Die gesamte zweidimensionale Fläche (a–d, gelber Ring) und der Kern (a–d, dunkelblauer Ring) wurde für jeden Erythrozyten in ImageJ29 (v2.0.0) berechnet. Die Gesamtoberfläche war in allen Höhlenpopulationen im Vergleich zur Oberfläche signifikant größer (p < 0,00003), unterschied sich jedoch nicht voneinander (e). Obwohl die gesamte zweidimensionale Fläche bei Höhlenfischen größer war, gab es keine Unterschiede in der zweidimensionalen Fläche der Kerne (f), was darauf hindeutet, dass die Unterschiede in der gesamten zweidimensionalen Fläche auf Unterschiede im Zytoplasma zurückzuführen sind, in dem Hämoglobin vorkommt . Es wurden zwei Ausreißer festgestellt (der höchste Chica-Wert und der niedrigste Pachón-Wert). Durch die Entfernung dieser Ausreißer änderte sich die statistische Signifikanz nicht (Tabelle S6).

Wenn Unterschiede im Hämatokrit zwischen Populationen nicht durch eine erhöhte Anzahl von Erythrozyten bestimmt werden, schlussfolgerten wir, dass die Variation des Hämatokrits mit Unterschieden in der Erythrozytengröße korrelieren könnte. Qualitative Vergleiche schienen diesen Trend aufzuzeigen. Um dies quantitativ zu testen, führten wir Korrelationen sowohl für die mittlere Erythrozytengröße als auch für die mittlere Erythrozytendichte im Verhältnis zum mittleren Hämatokritwert durch. Messungen der Erythrozytendichte zeigten eine schlechte Korrelation zum Hämatokrit (r = – 0,433, Abb. 5a). Im Gegensatz dazu zeigte die Erythrozytenfläche eine starke positive Korrelation mit dem Hämatokrit (r = 0,869, Abb. 5b), was darauf hindeutet, dass die Variation des erhöhten Hämatokrits in den Astyanax-Cavefish-Populationen eine Funktion der Erythrozytengröße ist.

Die Erythrozytengröße korreliert positiv mit den Hämatokritwerten bei Astyanax-Höhlen- und Oberflächenfischen. Wir haben Pearson-Korrelationen durchgeführt, um zu bestimmen, welches erythrozytische Merkmal (Dichte oder Größe) mit dem Hämatokrit korreliert. Die mittlere Erythrozytendichte korrelierte nicht mit dem Hämatokrit (r = − 0,4329, a). Die zweidimensionale Oberfläche der Erythrozytenpopulation ergab jedoch eine starke, positive Korrelation mit dem Hämatokritwert (r = 0,8688, b).

Wir haben dies weiter ausgewertet, indem wir das mittlere korpuskuläre Hämoglobin (MCH, „Material und Methoden“) berechnet haben, eine Metrik, die die Hämoglobinkonzentration mit der Erythrozytendichte integriert, um die Hämoglobinmasse in einem einzelnen roten Blutkörperchen abzuschätzen. In Übereinstimmung mit anderen Erkenntnissen hatte die Oberflächenpopulation den niedrigsten mittleren MCH-Wert (mittlerer MCH = 39,41 pg, Tabelle 1), während die Chica-Population den höchsten der drei Höhlenpopulationen aufwies, gefolgt von Tinaja und Pachón (mittlerer MCH = 66,01 pg, Tabelle 1). 65,02 pg bzw. 52,20 pg; Tabelle 1). Somit trägt eine erhöhte Erythrozytengröße (verbunden mit einem erhöhten Hämatokrit) wahrscheinlich zu einem erhöhten Hämoglobinspiegel in natürlichen Höhlenfischpopulationen bei.

Beim Menschen stellen Hämatokritwerte ein relatives Maß für den prozentualen Beitrag der Erythrozyten zu einem bestimmten Blutvolumen dar, da die Größe der roten Blutkörperchen in der gesamten menschlichen Bevölkerung stabil ist30. Höhlenfische haben im Vergleich zu Oberflächenfischen einen höheren Hämoglobinspiegel. Bei Höhlenfischen sind die Hämatokritwerte erhöht, dies ist jedoch wahrscheinlich auf größere (und nicht auf mehr) Erythrozyten zurückzuführen.

Hier berichten wir, dass Astyanax-Höhlenmorphe (aus drei verschiedenen Höhlenorten: Chica, Pachón und Tinaja) im Vergleich zu eng verwandten Oberflächenfischen konvergent höhere Konzentrationen an Bluthämoglobin entwickelt haben. Dieses erhöhte Hämoglobin könnte es Höhlenfischen ermöglichen, pro Zeiteinheit mehr Sauerstoff an systemische Gewebe abzugeben. Dies kann die Aufrechterhaltung der aeroben Atmung in Zeiten reduzierten Sauerstoffgehalts ermöglichen, um eine anhaltende Nahrungssuche zu unterstützen31,32,33,34. In Übereinstimmung mit einem erhöhten Hämoglobinwert weisen Höhlenmorphs höhere Hämatokritwerte auf. Obwohl dies typischerweise auf eine höhere Dichte an Erythrozyten hinweist27,28, hatten Höhlenfische im Vergleich zu Oberflächenfischen nicht mehr rote Blutkörperchen. Vielmehr variierten die Erythrozytengrößen zwischen den Höhlen- und Oberflächenpopulationen, wobei Höhlenfische durchweg eine erhöhte Größe der roten Blutkörperchen beherbergten, was zum Teil ihre höheren Hämoglobinwerte erklärt.

Zu den herausfordernden Umweltbelastungen, denen Höhlenfische ausgesetzt sind, wie ständige Dunkelheit und begrenzte Nahrung, gehört im Vergleich zu darüber liegenden Oberflächengewässern ein geringerer Sauerstoffgehalt6. Es wurde gezeigt, dass begrenzter Sauerstoff das Verhalten, die Physiologie und bestimmte Morphologien bei anderen Knochenfischarten beeinflusst16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,35. Zukünftige Studien in unserem System bieten die Möglichkeit, diese Merkmale direkt zwischen der konspezifischen „Ersatz-Vorfahren“-Morphart, die in gut sauerstoffreichen Umgebungen lebt, mit abgeleiteten Höhlenmorphen zu vergleichen, die seit Zehntausenden bis Hunderttausenden von Jahren in sauerstoffarmen Gewässern gediehen2. 3.

Die Diskrepanz in der Erythrozytengröße zwischen Astyanax-Populationen liefert mindestens eine Erklärung für den erhöhten Hämatokrit und die Hämoglobinkonzentration in Höhlenmorphen. Interessanterweise variiert die Größe der Erythrozyten zwischen den Knochenfischarten stark. Snyder und Sheafor36 schlugen vor, dass eine Variation der Erythrozytengröße eine effiziente Sauerstoffdiffusion aufrechterhält, allerdings als Funktion unterschiedlicher Kapillardurchmesser. Obwohl sowohl die Zell- als auch die Kapillargröße von Taxa zu Taxa variieren können, bleibt die Beziehung zwischen beiden konstant. Im Durchschnitt ist die Erythrozytenbreite 25 % größer als der Kapillardurchmesser36. Interessanterweise fanden sie keinen Zusammenhang zwischen der Erythrozytengröße und der Sauerstofftransportkapazität (einschließlich der Hämoglobinkonzentration) und kamen daraus zu dem Schluss, dass die Erythrozytengröße variiert, um einen effizienten Fluss und eine effiziente Diffusion aufrechtzuerhalten.

Lay und Baldwin37 untersuchten, ob die Kerngröße oder die Sauerstoffzufuhr die Variation der Erythrozytengröße bei 52 Knochenfischarten besser erklärt, und fanden eine umgekehrte Beziehung zwischen Erythrozytengröße und Hämoglobinkonzentration. Interessanterweise berichteten sie auch über einen umgekehrten Zusammenhang zwischen der Erythrozytengröße und der aeroben Schwimmfähigkeit28,38. Insbesondere Fische, die mit kurzen, schnellen Bewegungen schwimmen, neigen dazu, kleinere Erythrozyten zu haben, und ein erhöhtes aerobes Schwimmen war mit einer höheren Anzahl an Erythrozyten verbunden39.

Eine Erklärung für diesen Zusammenhang könnte sein, dass ein größeres Verhältnis von Oberfläche zu Volumen in Erythrozyten die Sauerstoffdiffusionsstrecke verringert und so bei Bedarf eine schnellere Sauerstoffbeladung ermöglicht37. Da das Volumen schneller zunimmt als die Oberfläche und die Erythrozyten von Höhlenfischen größer sind als die von Oberflächenfischen, weisen Höhlenfisch-Erythrozyten wahrscheinlich ein geringeres Verhältnis von Oberfläche zu Volumen auf. Die Höhlenmorphaktivität zeichnet sich durch eine höhere mittlere Geschwindigkeit im Vergleich zu Oberflächenfischen aus34, Oberflächenfische nutzen jedoch schnelle, kurze „stoßartige“ Bewegungen40. Da Höhlenfische weniger, dafür aber größere Erythrozyten besitzen, könnte dies auf ihre unterschiedlichen natürlichen Aktivitätsniveaus zurückzuführen sein. Ähnliche Ergebnisse wurden von Tang et al.12 im Zusammenhang mit Unterschieden in der Herzgröße und -form zwischen Morphotypen diskutiert. Höhlenfische besitzen kleinere, weniger dreieckige, aber daher „schwammigere“ Herzen als Oberflächenfische. Schwammigere Herzen haben ein geringeres Verhältnis von kompaktem Wandgewebe zu Knochenbälkchen, was mit einem sitzenden Aktivitätsprofil verbunden ist41. Darüber hinaus haben Herzen mit mehr Trabekeln eine größere Oberfläche, die dem zirkulierenden Blut ausgesetzt ist, was einen erhöhten Gasaustausch ermöglicht, was daher für Höhlenfische in hypoxischen Umgebungen von Vorteil sein kann12.

Hier haben wir mehrere Blutphänotypen gemessen, die dem Astyanax-Höhlenfisch in hypoxischen Höhlen wahrscheinlich einen adaptiven Vorteil verschaffen. Vieles ist jedoch noch unbekannt, einschließlich der zugrunde liegenden Mechanismen, die bei dieser Art eine Hypoxieresistenz ermöglichen. Zukünftige Studien zur Charakterisierung allgemeiner Genexpressionsveränderungen als Reaktion auf Hypoxie-Gefangenschaft42,43,44 könnten wichtige, unterschiedlich exprimierte Gene aufdecken, die sich auf die Hypoxietoleranz auswirken. Beispielsweise zeigen bestimmte im Viktoriasee beheimatete Buntbarschpopulationen45,46 eine unterschiedliche Expression von Hämoglobin, basierend auf der unterschiedlichen Hypoxieexposition der Vorfahrenpopulationen. Darüber hinaus können Änderungen der Kodierungssequenz in Hämoglobin-Genen die Funktion des kodierten Proteins beeinträchtigen und möglicherweise die Sauerstoffbindungskapazität bei unterschiedlichen Umgebungssauerstoffgehalten im Laufe der Evolution verbessern20.

Eine umfangreiche Forschungsarbeit hat Dutzende adaptiver Reaktionen auf Hypoxie bei Knochenfischen identifiziert47. Weitere Anpassungen bei Astyanax können Veränderungen der Kiemenanatomie und -funktion umfassen. Beispielsweise stellten Moran et al.11 fest, dass die Kiemen von Pachón-Höhlenfischen im Vergleich zu Oberflächenmorphen schwerer sind und dass die mittlere Kiemenmasse von Pachón/Oberflächen-F2-Hybriden größer war als die der elterlichen Oberflächenpopulation. Dies kann darauf hindeuten, dass eine positive Selektion als Folge einer Hypoxie in Höhlen auftritt11. Karausche können ihre Kiemen „umgestalten“, um den Sauerstoffaustausch zu verbessern und unnötigen, energieintensiven Ionenaustausch einzuschränken17,48. Es ist denkbar, dass ähnliche Veränderungen der Kiemenmorphologie zu einer effizienteren Sauerstoffaufnahme und Energieeinsparung in hypoxischen Höhlen führen.

Schließlich haben sich bei Höhlenfischen neben der Entwicklung regressiver Merkmale (z. B. Augenverlust) viele konstruktive nicht-visuelle Sinnesmerkmale entwickelt, wie z. B. die Erweiterung der Seitenlinie49,50 und des Geschmackssystems51,52. Eine nicht untersuchte sensorische Modalität bei Astyanax ist die Sauerstoffwahrnehmung. Neuroepithelzellen (NECs) sind die primären Sauerstoffsensorzellen bei Fischen und sind in einer dünnen Epithelschicht innerhalb von Kiemenfilamenten und -lamellen verteilt, die den efferenten Teil der Kieme bedecken53. Aufgrund der Positionierung dieser Zellen können sie eine Rolle bei der Wahrnehmung sowohl externer (Umgebungswasser) als auch interner (Arteriolen) Änderungen des Sauerstoffpartialdrucks spielen53. Darüber hinaus sind diese Zellen homolog zu Chemorezeptoren vom Typ I, die sich im Glomus caroticum von Säugetieren befinden54. Wesentliche Unterschiede in der Ionenkanalexpression von NECs tragen zur Sauerstofftoleranz bei anoxieresistenten Goldfischen bei55. Angesichts der Tatsache, dass andere Sinnessysteme durch das Leben in der extremen Höhlenumgebung erweitert werden, könnten sich ähnliche Veränderungen in der Sauerstoffwahrnehmung entwickelt haben, um mit reduzierten Sauerstoffbedingungen zurechtzukommen.

Alle in dieser Studie verwendeten Tiere wurden in einer Satelliten-Wasseranlage an der Universität von Cincinnati gehalten und entweder in 5- oder 10-Gallonen-Tanks in einer maßgeschneiderten Umkehrosmose-Haltungseinheit mit mehreren Filtern (Kohlenstoff, Mikron, UV und dichte Partikel) gehalten Filter; Aquaneering, San Diego, CA). Dieses System konditioniert Wasser mithilfe einer Echtzeit-Dosisüberwachung auf eine Temperatur von 24 ° (± 2 °C), einen pH-Wert von 7,4 (± 0,2) und eine Leitfähigkeit von 750 µS/cm (± 50 µS/cm). Sowohl die Astyanax-Höhlenpopulationen (Pachón, Tinaja und Chica) als auch die Oberflächenmorphs wurden im 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus gehalten und einmal täglich (~ 9:00 Uhr) mit einer Mischung aus trockenem Flockenfutter (TetraMin Pro) und Systemwasser gefüttert . Die in dieser Studie verwendeten Oberflächenfische, Tinaja- und Pachón-Cavefish, stammten aus der Zucht erwachsener Astyanax mexicanus-Exemplare, die ursprünglich von Dr. Richard Borowsky zur Verfügung gestellt wurden. Chica-Höhlenfische wurden kommerziell erworben und daher ist das genaue Alter dieser Individuen unbekannt. Bestimmte Blutparameter, einschließlich Hämatokrit, können sich beim Menschen mit dem Alter ändern. Daher haben wir in dieser Studie die biologische Variation minimiert, indem wir Fische mit einer Standardlänge von < 40 mm ausgeschlossen haben. Standardlängenmessungen wurden nicht für jedes Individuum aufgezeichnet, obwohl jedes Individuum die Standardlänge von 40 mm überschritt.

Die Tiere wurden mit eiskaltem Systemwasser anästhesiert und Blut wurde über die Schwanzvene mit einer 31G-Spritze (BD Ultra-Fine™, BD Biosciences, San Jose, CA) gesammelt. Wir verwendeten Fische vergleichbaren Alters und vergleichbarer Standardlänge in allen Populationen und stellten fest, dass keiner der Faktoren einen signifikanten Einfluss auf den phänotypischen Score in dieser Studie hatte (Ergänzungstabellen S1–S4). Die Abholungen fanden zwischen 12:00 und 17:00 Uhr statt, um mögliche Auswirkungen des Diesels zu minimieren. Alle Haltungsbedingungen und Sammelmethoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Cincinnati genehmigt (IACUC-Protokoll Nr. 10-01-21-01).

Die Hämoglobinkonzentrationen wurden mit einem Aimstrip-Hämoglobinmessgerät (Germaine Laboratories, San Antonio, TX, USA) gemessen. Das Messgerät wurde vor jedem Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers kalibriert und optisch überprüft. 10 µL Vollblut wurden auf einen Teststreifen (Abb. 1c) gegeben und in das Hämoglobinmessgerät eingeführt. Die Konzentrationen wurden automatisch mittels Spektrophotometrie berechnet und in g/dl angezeigt.

Die Hämatokritwerte wurden durch Zentrifugation unter Verwendung einer LW Scientific ZipCombo-Zentrifuge (LW Scientific, Lawrenceville, GA) gemessen, die mit einem Mikrohämatokritrotor mit 12 Plätzen ausgestattet war. Vollblut wurde in einem Kapillarröhrchen gesammelt und am anderen Ende mit Ton verschlossen. Jedes Kapillarröhrchen wurde gemäß Herstellerempfehlung 3 Minuten lang bei 12.000 U/min gedreht. Die Blutbestandteile wurden in Phasen getrennt: Die weitaus zahlreicheren und größeren Erythrozyten sammeln sich in der unteren Phase, während sich der Buffy Coat (hauptsächlich weiße Blutkörperchen und Blutplättchen) und das Blutplasma über den Erythrozyten befinden (Abb. 2a). Gemessen wurde die Länge der Erythrozytenphase und die Länge des gesamten Blutvolumens. Der Hämatokritanteil wurde bestimmt, indem die Länge der Erythrozytenphase durch das Gesamtblutvolumen dividiert wurde.

Um die Dichte der Erythrozyten für jede Population zu bestimmen, wurde ein verbessertes Neubauer-Hämozytometer (Hausser Scientific, Horsham, PA) verwendet (Abb. 3a). 1 µL Vollblut wurde in einer Färbelösung aus 500 µL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1×) und 20 µL einer Arbeitslösung des Kernfärbemittels Acridine Orange (A1301, Invitrogen von Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) verdünnt. Diese Verdünnung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 µl auf das Hämozytometer gegeben und mit einem Leica DM2000 LED-Verbundmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit einer am Mikroskop montierten Leica DMC4500-Kamera und der Leica Application Suite (LAS) X-Software (Version 3.0.1.15878) aufgenommen.

Das Hämozytometer ist mit komplizierten Gitterätzungen ausgestattet (Abb. 3a), um eine präzise Methode zur Zählung der Zellzahl innerhalb eines präzisen Bereichs zu ermöglichen. Die größte sichtbare quadratische Fläche mit unserem zusammengesetzten Zielfernrohr betrug 0,75 mm × 0,75 mm oder 0,5625 mm2. Für jedes Individuum wurden drei verschiedene Flächen von 0,5625 mm2 gezählt und gemittelt.

Um das Gesamtvolumen abzuschätzen, wurde das Hämozytometer so konstruiert, dass die Schultern auf beiden Seiten der Plattform ein Deckglas genau 0,1 mm über der Plattform tragen. Somit beträgt das Gesamtvolumen in diesem Abschnitt 0,05625 mm3. Die Zellzählungen wurden mit ImageJ29 (v2.0.0) durchgeführt, indem zunächst das Tool „Farbschwelle“ verwendet wurde. Der Schwellenwert wurde für jedes Bild manuell angepasst, um optische Artefakte zu vermeiden. Anschließend wurde die quadratische Fläche ausgewählt und die Zählung mit dem Tool „Partikel analysieren“ abgeschlossen. Dieses Tool ermöglicht den Größenausschluss, um sicherzustellen, dass Artefakte nicht gezählt werden. Erythrozyten sind viel größer als weiße Blutkörperchen, daher haben wir Merkmale mit einer Größe von weniger als 30 µm2 ausgeschlossen. Wir haben die Anzahl der Zellen pro 1 mm3 (dh die Zelldichte) berechnet, indem wir die Rohzellzahl durch das Volumen (0,05625 mm3) dividiert und mit dem Verdünnungsfaktor (520) multipliziert haben.

7,5 µl Vollblut wurden auf einen Objektträger aufgetragen, ausgestrichen, an der Luft getrocknet und mit Wright-Giemsa, modifizierter Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers (WG16, Millipore Sigma, Burlington, MA, USA) gefärbt. Neun Zellen wurden zufällig ausgewählt und für jedes Individuum manuell gemessen und gemittelt. Die Ausrichtung jeder ausgewählten Zelle war parallel zum Objektträger (der kurze und lange Zelldurchmesser bei maximaler Länge), berührte keine andere Zelle und war frei von offensichtlichen Deformationen. Alle Zellen wurden mit den Werkzeugen „Polygonauswahl“ und „Messen“ in ImageJ29 abgebildet und gemessen. Die Pixel wurden für jedes Bild mithilfe der abgebildeten Maßstabsleiste (LAS Die Kernfläche jedes Erythrozyten wurde unter Verwendung des identischen Protokolls gemessen, das zur Messung der gesamten zweidimensionalen Fläche verwendet wurde, wie oben beschrieben.

Alle statistischen Analysen wurden in R56 (Version 3.6.1) unter Verwendung der Basispakete „stats“56 und „Rmisc“57 durchgeführt. Für jeden Test wurden mindestens acht Personen aus jeder Population verwendet, da dies die größte Anzahl geeigneter Personen aus der kleinsten Laborpopulation darstellte. Wenn möglich, wurde die Verblindung einbezogen, indem ein Prüfer Daten sammelte (Zellen abbildete), einen Identifikationsschlüssel erstellte und die individuelle Nomenklatur entfernte, bevor ein zweiter Prüfer die Daten quantifizierte und an Prüfer eins zurücksendete. Wilcoxon-Rangsummentests (WRS) wurden verwendet, um die statistische Signifikanz für Hämoglobinkonzentrationen, Hämatokrit, Erythrozytendichte und Erythrozytengröße festzustellen. Alle p-Werte für diese Tests wurden für mehrere Vergleiche Bonferroni-korrigiert. Statistische Signifikanz wurde erreicht, wenn p < 0,0083. Pearsons Korrelationen wurden in R56 unter Verwendung des Basispakets „stats“56 berechnet. Die Normalität wurde für jede Population in jedem Assay mit dem Shapiro-Wilk-Normalitätstest getestet. Alle Populationen folgten der Normalverteilung mit Ausnahme der Kernflächenmessungen von Pachón 2d (Tabelle S5). Eine zusätzliche Analyse wurde durchgeführt, um das Vorhandensein von Ausreißern zu testen. Wir haben alle Populationen in jedem Assay mit dem Hampel-Filter58 getestet. Dieser Test erkannte zwar Ausreißer, die Entfernung der Ausreißer wirkte sich jedoch nur auf eine einzige statistische Signifikanz aus (Abb. 3b, Tabelle S6). Alle gesammelten Daten (einschließlich Ausreißer) werden in diesem Manuskript dargestellt. In allen Tests wurden sowohl männliche als auch weibliche Fische einbezogen. Basierend auf Wilcoxon-Rangsummentestanalysen scheint das Geschlecht kein biologischer Faktor in den von uns untersuchten Blutparametern zu sein (n = 42 für die Hämoglobinkonzentration und n = 32 für Hämatokrit, Erythrozytendichte und 2D-Flächenmessungen, jeweils inklusive Morph). für jeden Assay (Ergänzungstabellen S1–S4). Das mittlere korpuskuläre Hämoglobin (MCH) schätzt die Masse des Hämoglobinproteins pro Erythrozyten. Dieser Wert wird berechnet, indem die Anzahl der Gramm Hämoglobin pro Liter durch die Anzahl der roten Blutkörperchen in Millionen pro Milliliter dividiert wird, was Pikogramm Hämoglobin pro rotem Blutkörperchen ergibt59. Streudiagramme wurden in R56 mit dem Paket „ggpubr“60 erstellt. Boxplots wurden in R56 mit dem Paket „ggplot2“61 erstellt. In diesen Diagrammen erstrecken sich Whiskers bis zum kleinsten oder größten Wert, der 1,5xIQR nicht überschreitet, und horizontale Linien stellen das erste und dritte Quartil sowie den Median dar. Alle Bilder wurden in Microsoft PowerPoint (Version 16.23) bearbeitet.

Das Institutional Animal Care and Use Committee der University of Cincinnati (IACUC-Protokoll Nr. 10-01-21-01) genehmigte alle Haltungsbedingungen und Sammelmethoden für die Verwendung von Astyanax mexicanus in dieser Studie. Darüber hinaus entsprach diese Studie den in der Basler Erklärung und den ARRIVE-Richtlinien dargelegten Grundsätzen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind in den Zusatzinformationen verfügbar.

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Die Autoren möchten den derzeitigen und ehemaligen Mitgliedern des Gross-Labors für hilfreiche Diskussionen zu diesem Projekt und ihre Unterstützung bei der Fischzucht danken, insbesondere Daniel Berning und Alyssa Hamm.

Abteilung für Biowissenschaften, University of Cincinnati, Cincinnati, OH, 45221, USA

Tyler E. Boggs, Jessica S. Friedman und Joshua B. Gross

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TEB und JBG entwarfen Experimente, TEB und JSF führten Experimente durch, TEB und JBG analysierten die Daten und TEB und JBG schrieben den Haupttext. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Joshua B. Gross.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 19. November 2021

Angenommen: 15. Februar 2022

Veröffentlicht: 08. März 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-07619-0

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