Ein Tief - Oceanic Blue Group Co., Ltd

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 2722 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Ein Großteil unseres Verständnisses der Zell- und Gewebeentwicklung, -struktur und -funktion stammt aus der Fluoreszenzmikroskopie. Die Aufnahme farbenfroher und leuchtender Bilder fesselt und begeistert Benutzer, vom erfahrenen Mikroskopiker bis zum MINT-Studenten. Die Kosten für Fluoreszenzmikroskope liegen zwischen mehreren tausend und mehreren hunderttausend US-Dollar. Daher ist der Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie in der Regel auf gut finanzierte Institutionen und Biotechnologieunternehmen, zentrale Forschungseinrichtungen und medizinische Labore beschränkt, an vielen Universitäten und Hochschulen, Grund- und weiterführenden Schulen (K-12) sowie in der Wissenschaft ist sie jedoch finanziell nicht praktikabel Outreach-Einstellungen. In dieser Studie haben wir Komponenten entwickelt und charakterisiert, die in Kombination mit einem Smartphone oder Tablet Fluoreszenzmikroskopie zu Kosten von weniger als 50 US-Dollar pro Einheit durchführen. Wir haben Freizeit-LED-Taschenlampen und Theaterbühnenbeleuchtungsfilter umfunktioniert, um die Betrachtung grüner und roter Fluorophore, einschließlich EGFP, DsRed, mRFP und mCherry, auf einem einfach zu bauenden Rahmen aus Holz und Plexiglas zu ermöglichen. Diese Geräte, die wir als Glowscopes bezeichnen, waren in der Lage, Fluoreszenz in lebenden Proben mit einer Auflösung von 10 µm abzubilden, und waren mit allen von uns getesteten Smartphone- und Tablet-Modellen kompatibel. Im Vergleich zu Fluoreszenzmikroskopen in wissenschaftlicher Qualität weisen Glowscopes möglicherweise Einschränkungen in der Empfindlichkeit auf, die zur Erkennung schwacher Fluoreszenz erforderlich ist, und können subzelluläre Strukturen nicht auflösen. Wir demonstrieren die Fähigkeit, Fluoreszenz innerhalb von Zebrafischembryonen zu betrachten, einschließlich Herzfrequenz, Rhythmus und regionaler Anatomie des Zentralnervensystems. Aufgrund der geringen Kosten einzelner Glowscope-Einheiten gehen wir davon aus, dass dieses Gerät dazu beitragen kann, Klassenräume für Grund- und Grundschulklassen sowie naturwissenschaftliche Unterrichtsräume mit Flotten von Fluoreszenzmikroskopen auszustatten, die Schüler in praktische Lernaktivitäten einbeziehen können.

Fortschritte in der Smartphone- und Tablet-Kameratechnologie haben Wissenschaftlern, Pädagogen und Studenten leistungsstarke Kameras in die Hand gegeben. Die Auflösung und Empfindlichkeit moderner Smartphone- und Tablet-Kameras übertrifft die Fähigkeiten vieler wissenschaftlicher Kameras, die noch immer für Forschungsanwendungen eingesetzt werden. Mit jährlichen Verbesserungen der Empfindlichkeit der Smartphone-Kamera, des Pixel-Binnings und der Auflösung sowie der Videobildratenfunktionen treten wir in eine Ära ein, in der diese Geräte qualitativ hochwertige Bild- und Videoaufnahmen für den naturwissenschaftlichen Unterricht und die Forschung durchführen können. Dementsprechend wurden Produkte entwickelt, um Smartphones zur Bildaufnahme an Mikroskopokularen zu befestigen. Darüber hinaus wurden eigenständige „Smartphone-Mikroskop“-Designs für den Einsatz in K-12- und naturwissenschaftlichen Grundausbildungsumgebungen1,2,3,4,5,6, Forschungs- oder klinischen Umgebungen7,8,9,10,11 und geowissenschaftlichen Anwendungen12 entwickelt .

Die Fluoreszenzmikroskopie erzeugt optisch ansprechende Bilder, die den Kontrast bestimmter Merkmale der betrachteten Probe erheblich verbessern können. Für diese mikroskopische Bildgebungsmodalität waren in der Vergangenheit kostspielige und umständliche Quecksilberdampflampen oder -laser erforderlich. In den letzten Jahren ersetzt jedoch die vergleichsweise kostengünstige und kompakte Laserdiodentechnologie (LED) Quecksilberdampflampen und Laser in der Mikroskopieindustrie. Zu den Vorteilen gehören geringere Kosten, längere Lebensdauer und wartungsfreier Betrieb. Da LEDs so konstruiert sind, dass sie Licht praktisch jeder Wellenlänge im sichtbaren Lichtspektrum emittieren und bei Bedarf gefiltert werden können, werden LEDs in der Mikroskopie-Community häufig als Anregungslichtquelle für die Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt.

In dieser Studie wollten wir ein Smartphone-Fluoreszenzbildgebungssetup mit einem angestrebten Baupreis von unter 50 US-Dollar pro Einheit entwickeln. Wir demonstrieren die Fähigkeit dieser Geräte, die wir als „Glowscopes“ bezeichnen, grüne und rote Fluorophore zu erkennen und Veränderungen der Herzfrequenz und Rhythmik bei embryonalen Zebrafischen zu überwachen und zu erkennen. Wir diskutieren und demonstrieren Möglichkeiten für Lehrkräfte im Bachelor- und K12-Bereich, diese Ressourcen zu nutzen, um lokale und wissenschaftliche Standards der nächsten Generation zu erfüllen.

Alle in dieser Studie durchgeführten Zebrafischarbeiten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Winona State University genehmigt. Alle Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften dieses Tierpflege- und Verwendungsprotokolls und den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org/) durchgeführt. An der Forschungsstudie waren keine menschlichen Teilnehmer beteiligt. Zebrafisch-Embryonen (Danio rerio) wurden bei 28 °C in Eiwasser (0,0623 g/l Coralife-Meeressalz) aufgezogen und nach Stunden nach der Befruchtung oder nach morphologischen Kriterien ins Stadium gebracht. Zu den in dieser Studie verwendeten transgenen Linien gehörten Tg(olig2:DsRed)vu19, Tg(nkx2.2a:EGFP-CaaX)vu16, Tg(phox2bb:EGFP)w37, Tg(mbpa:EGFP-CaaX; myl7:mCherry), auf die im Folgenden Bezug genommen wird als Tg(myl7:mCherry)13, Tg(sox10:mRFP)vu234 und Tg(UAS:EGFP-CaaX, myl7:EGFP)co18, das im Folgenden als Tg(myl7:EGFP) bezeichnet wird. Um Embryonen und Larven für die Betrachtung reversibel zu lähmen, wurde die Stammlösung von Tricainmethansulfonat (Western Chemical, Inc.) (0,116 M) direkt in die Petrischale mit Eiwasser in einem Verhältnis von 0,5–1 ml (Tricain) zu 20 ml (Ei) gegeben Wasser). Eine Astemizol-Stammlösung (10 mM in DMSO) wurde zur Behandlung von Zebrafischen durch direkte Zugabe zum Eiwasser für eine Endkonzentration von 10 oder 30 µM (wie angegeben) verwendet. Alle anderen in dieser Studie verwendeten Tiere wurden vor der Verwendung vor Ort gesammelt. Das Beobachten lebender Insekten in Petrischalen wurde erleichtert, indem die Schale auf Eis gestellt wurde, um die Bewegung zu verlangsamen. Ein ReptiTherm UTH wurde zur Temperaturerhöhung für Herzfrequenzstudien (Zoomed) verwendet. Die Oberfläche dieses Heizkissens wurde zum Zeitpunkt der Verwendung mit einem Infrarot-Thermometer bei 35 °C gemessen. Die Behandlung von Zebrafischembryonen mit saurem Wasser wurde mit Haushaltsessig (10 % in Eierwasser) für 30 Minuten zwischen der Bestimmung der Herzfrequenz vor und nach der Behandlung durchgeführt. Für das durch Fischbeute hervorgerufene Verhalten wurde eine einzelne Zebrafischlarve (5 dpf) in eine 30-mm-Petrischale mit 5 ml Eiwasser gegeben. Zur Beobachtung des Zebrafisch-Beutefangs wurden lebende Paramecium bursaria (Carolina Biologicals) direkt mit dem Eiwasser in einer Konzentration von 30 Paramecium pro 1 ml vorgemischt, die vor ihrer Zugabe durch mikroskopische Betrachtung von dreifachen Proben bestimmt und verdünnt wurde, um dies zu erreichen dieser Zielkonzentration.

Eine vollständige Teileliste, Konstruktions- und Montageinformationen finden Sie in den ergänzenden Methoden. Kurz gesagt, geschnittenes Sperrholz oder Verbundmaterial wurde mit einer Plexiglasoberfläche (Polycarbonat oder Acryl) zusammengesetzt. In das Plexiglas wurden Löcher gebohrt, um eine freie Sichtöffnung für die Smartphone-Kamera zu schaffen. Ein zusätzliches Plexiglasstück wurde zugeschnitten, um als bewegliche Bühnenplattform zu dienen, die durch Unterlegscheiben und Klammern fixiert wird. Ein aufsteckbares Makroobjektiv (Lieront, gekauft bei www.amazon.com, beworben als 25-fach-Makro) wurde verwendet, um Smartphone-Bilder für Fluoreszenz zu vergrößern. Zur Bestimmung der maximal erreichten Bildauflösung wurde ein USAF-Testdiagramm von 1951 (www.edmundoptics.com, Katalog-Nr. 3857) verwendet. Nachdem das Bild mit maximalem Digitalzoom aufgenommen wurde, ermittelten wir die kleinsten Linien, die klar getrennt werden konnten, und die lp/mm, die sie darstellen (x). Die Auflösung (in Mikrometer) wurde wie folgt berechnet: µm = 1000 / (x * 2).

Für die GFP-Beleuchtung wurde eine blaue LED-Stirnlampe (Topme, gekauft bei www.amazon.com, beworben als Angelscheinwerfer) oder eine mehrfarbige LED-Taschenlampe (Lumenshooter, gekauft bei www.amazon.com, beworben als taktische Taschenlampe) verwendet . Um Streulicht im grünen und gelben Wellenlängenbereich zu reduzieren, wurde eine Gelbeleuchtungsfolie für die Theaterbühne (Rosco Nr. 4990, CalColor Lavender) ausgeschnitten und zwischen der LED und der Fokussierlinse des Scheinwerfers eingefügt. Rosco #14 (Medium Straw) und #312 (Canary) Gelfolie für Theaterbühnenbeleuchtung wurde einzeln oder in Kombination als Emissionsfilter verwendet. Die LED-Lampe wurde in einem Winkel von ungefähr 45 Grad über und innerhalb von 3 bis 6 Zoll von den Proben gehalten. Emissionsfilter wurden zwischen der Acrylplattform und der Aufstecklinse platziert. Für die Abbildung rot fluoreszierender Proteine wurden Rosco Nr. 88 (Hellgrün) und Nr. 89 (Moosgrün) zur Beleuchtung (Anregungsfilter) sowie Nr. 19 (Feuer) als Emissionsfilter verwendet. Alle Rosco-Filter wurden bei www.stagelightingstore.com oder www.bhphotovideo.com gekauft. Ein Vernier-Emissionsspektrometer (VSP-EM, www.vernier.com) wurde verwendet, um die Auswirkungen von Anregungsfiltern zu bewerten. Mit der Vernier Spectral Analysis-Software (Version 4.11.0–1543) wurden Daten erfasst und in das CSV-Format konvertiert, die dann in Microsoft Excel importiert und anschließend zum Erstellen von Diagrammen mit GraphPad Prism (Version 7.0, GraphPad) verwendet wurden. Ein mit einem Lichtsensor (Vernier LS-BTA) gekoppelter Vernier LabPro wurde verwendet, um die Lichtintensität blauer LED-Taschenlampen in Kombination mit der Software Vernier Logger Pro 3 (Version 3.16.2) zu bewerten. Mit einem Multimeter (Amprobe 30XR-A) wurde die Stromaufnahme zwischen Batterie und LED am blauen LED-Scheinwerfer gemessen.

Für die Bildaufnahme wurden Apple- und Samsung-Geräte verwendet. Sofern nicht anders angegeben, wurde die gesamte Bildaufnahme mit einem iPhone XR (Apple) durchgeführt. Der Einfachheit halber wurden Zeitraffervideos des embryonalen Zebrafischherzens mit der ProCam 8-App aufgenommen, die es ermöglichte, das 1X-Objektiv für die Verwendung zu sperren und den digitalen Zoom auf 4,0X zu erweitern. Es wurde eine Videoaufnahme mit einer Auflösung von 1080p und 60 Bildern pro Sekunde (fps) verwendet, da eine Auflösung von 4K oder höhere Bildraten die Fluoreszenzempfindlichkeit und das Signal-Rausch-Verhältnis verringerten. Alle Bilder und Videos wurden mit Airdrop (Apple) oder einem USB-Kabel auf einen Laptop übertragen, um eine Videodatenkomprimierung zu vermeiden. Videos wurden nach Fidschi14 importiert, indem zunächst Videos mit Adobe Photoshop in eine Reihe von TIFF-Bildern (eines pro Frame) konvertiert wurden. Nach dem Öffnen von Smartphone-Videos in Photoshop wurden die Bilder zugeschnitten und dann mit dem Befehl „Datei exportieren Video rendern Photoshop-Bildsequenz (TIFF-Format)“ als Bildsequenz gespeichert. Die Bildsequenz wurde dann in Fidschi mit dem Befehl „Datei importieren Bildsequenz“ geöffnet. Für die nicht fluoreszierende Zeitrafferansicht von Paramecia, schwimmenden Zebrafischen sowie Fluchtreaktionen von Kaulquappen und Raupen verwendeten wir eine Auflösung von 1080p mit einer Aufnahme von 120 fps.

Bei Zebrafisch-Herzvideos wurde die Erkennung und Messung der Herzkammerbewegungen in einigen Videos durch die Kantenerkennung unterstützt. In diesen Fällen wurde Fiji verwendet, um Kanten mithilfe des Befehls „Prozess-Kanten suchen“ zu erkennen. Um Fluoreszenzveränderungen im Zusammenhang mit Atrium- und Ventrikelbewegungen zu erkennen, wurde die Roh- oder Kantenbildsequenz verwendet und in Fidschi weiter analysiert. Zunächst wurde der Befehl „Analyze Set Measurements“ verwendet, um Fiji anzuweisen, minimale und maximale Grauwerte, mittlere Grauwerte und den Grenzwert zu messen. Der Bildstapel wurde mit dem Befehl Image Type 8-bit in Graustufen konvertiert. In Fällen, in denen Bilddrift oder nichtbiologische Bewegungen auftraten, wurde der Befehl „Plugins Image Stabilizer“ verwendet, um dieses Problem zu beheben. Das Bild wurde nach potenziell interessierenden Regionen (ROI) gescannt, in denen sich die Herzkammerwände entlang der x-y-Achse kontinuierlich hin und her bewegten. Nachdem ein ROI definiert wurde, wurde er über das Fenster „Analyze Tools ROI Manager“ oder die Tastenkombination „t“ hinzugefügt. Gleichzeitig mit der Identifizierung eines ROI wurde das Fenster „Bildanpassungsschwelle“ verwendet, um einen Schwellenwert festzulegen, bei dem sich die beweglichen Kammerwände kontinuierlich in die ROI-Box hinein und aus dieser heraus bewegten. Sobald eine ideale Kombination aus Bildschwellenwert und ROI-Box-Position festgelegt war, wurde das Bild mithilfe des Befehls „Binär verarbeiten“ in Binärdaten konvertiert, wobei Standardeinstellungen, dunkler und schwarzer Hintergrund ausgewählt wurden. Um die Fluoreszenzintensität innerhalb des ROI über die Zeit zu messen, wurde das Multi-Measure-Tool im ROI-Manager (unter der Registerkarte „Mehr“) verwendet, um eine Reihe von Messungen über die Zeit zu erstellen. Die Rohdaten wurden ausgeschnitten und direkt in eine Microsoft Excel-Tabelle eingefügt. In der Tabelle wurden Formeln verwendet, um den Beginn jedes Herzschlags mithilfe der Spalte mit der maximalen Intensität zu identifizieren, und Diagramme wurden mit GraphPad Prism 7.0 erstellt. Der Beginn jedes Schlags wurde durch den Übergang von 0 auf 255 definiert.

Als Rahmen zur Unterstützung eines Smartphones oder Tablets zur Fluoreszenzbetrachtung haben wir ein Do-it-yourself-Mikroskopdesign angepasst, das häufig für die nicht-fluoreszierende Bildgebung verwendet wird3,4. Dieser Rahmen bestand aus einer Plexiglasplattform, um ein Smartphone (oder Tablet) auf der Probe zu halten (Abb. 1a). Eine Sekunde

Live-Ansicht nicht fluoreszierender Proben mit dem Glowscope-Rahmen. (a) Die Abbildung zeigt den Lichtweg für die Durchlichtbetrachtung. Zu den gezeigten Komponenten gehören das Smartphone, das Aufsteckobjektiv (schwarz), der Glowscope-Rahmen (grau), die Bühne und die Aussichtsplattform (transparent), die Petrischale mit einer Probe und eine LED-Arbeitslampe, die unter der Bühne und der Aussichtsplattform positioniert ist. (b) Die Bildansicht mit einer Smartphone-Kamera ohne Aufsteckobjektiv zeigt Zebrafischembryonen (blauer Pfeil, 3 dpf). Als Größenreferenz wird ein handelsüblicher Bleistift (Radiergummiseite) angezeigt. (c) Die Bildansicht mit der zusätzlichen Aufstecklinse zeigt die gleichen Zebrafischembryonen und den gleichen Radiergummi wie in Bild (b). Die in den Feldern (b–c) gezeigten Bilder sind in nativer Vergrößerung (nicht gestreckt) wie in der Live-Ansicht zu sehen und wurden mit einem Apple iPhone 12 Pro mit 1-fachem (mittlerer Vergrößerung) Objektiv und 6-fachem Digitalzoom aufgenommen.

Eine Plexiglasplattform, die unterhalb der Smartphone-Linse positioniert war, diente als Bühne für die Aufnahme der Probe. Die einstellbare Höhe des Plexiglastisches gewährleistete die Fokussierung auf die Probe. Holz- oder Verbundplatten, Muttern, Bolzen und Unterlegscheiben hielten die Plexiglasplattform und die Bühne an Ort und Stelle. Für die nicht fluoreszierende Bildgebung sorgte eine batteriebetriebene LED-Arbeitslampe, die unter der Probe positioniert war, für zusätzliches Licht, wenn die Umgebungsbeleuchtung nicht ausreichte (Abb. 1a).

Um die Vergrößerung und Auflösung über das Smartphone oder Tablet hinaus zu erhöhen, wurde ein zusätzliches „Clip-on“-Makroobjektiv über die Telefon- oder Tablet-Kamera geklemmt (Abb. 1a, c). Die in dieser Studie verwendete zusätzliche Aufstecklinse ermöglichte eine etwa fünffache Vergrößerung (Abb. 1b–c). Diese Größe hing vom Abstand der Probe zum Aufsteckobjektiv ab. Bei der Betrachtung embryonaler Zebrafische (2–4 Tage nach der Befruchtung), die ungefähr der Länge eines Radiergummis (2–3 mm Länge) entsprechen, konnten die Merkmale des Zebrafischkörperplans aufgrund der erhöhten Vergrößerung und Bildauflösung leicht beobachtet werden. Beispielsweise konnten anatomische Strukturen wie Auge, Herz, Eigelb und Schwanz mithilfe der aufsteckbaren Linse problemlos auf dem Live-Display beobachtet werden (Abb. 1c). Mithilfe von USAF-Testzielen haben wir eine Auflösung von 9,8 µm mit einer iPhone 11-Kamera mit zusätzlichem Aufsteckobjektiv gemessen. Dies entsprach erheblichen Verbesserungen der Bildauflösung und der anatomischen Details in der Live-Ansicht oder nach der Bildaufnahme. Nachdem die Bilder aufgenommen und digital gestreckt wurden, um sie auf einem Smartphone- oder Laptop-Bildschirm weiter zu vergrößern, konnte die aufsteckbare Linse problemlos anatomische Strukturen und sogar einzelne Pigmentzellen (Melanozyten) auflösen. Im Vergleich dazu waren dieselben Merkmale ohne das Aufsteckobjektiv nur schwer oder gar nicht zu erkennen (ergänzende Abbildung S1).

Um das Smartphone-Oszilloskop mit der Fähigkeit zur Fluoreszenzbildgebung auszustatten, haben wir als Nächstes Fluoreszenzlichtquellen und Filter hinzugefügt. Um Proben mit grüner Fluoreszenz zu betrachten, haben wir das LED-Arbeitslicht ausgeschaltet und stattdessen einen blauen LED-Scheinwerfer oder eine Taschenlampe verwendet (Abb. 2a). Wir verwendeten Filter für die Theaterbühnenbeleuchtung, um zu verhindern, dass das blaue Licht das Kameraobjektiv erreicht. Dazu haben wir den Filter direkt unter dem Aufsteckobjektiv und dem Smartphone platziert (Abb. 2a). Diese kostengünstigen „Emissionsfilter“ reduzierten den Fluoreszenzhintergrund des blauen Blitzlichts und ließen gleichzeitig die grüne Fluoreszenz der Probe durch den Filter passieren und die Kamera erreichen. Wir haben zunächst ein Musterpaket mit Theater- und Bühnenbeleuchtungsfiltern mit einem breiten Spektrum an spektralen Eigenschaften erhalten. Nachdem wir zahlreiche Filterfarboptionen getestet hatten, stellten wir fest, dass die Kombination von

Verwendung von Freizeit-LED-Taschenlampen und Theaterbühnenbeleuchtungsfiltern für die Smartphone-Grünfluoreszenzmikroskopie. (a) Schematische Darstellung der Komponenten, die für die Betrachtung grüner Fluoreszenz auf dem Glowscope verwendet werden. (b–d) Repräsentative Fluoreszenzbilder transgener Zebrafischembryonen (3–4 dpf, Seitenansichten), die grüne Fluoreszenz in zelltypspezifischen Mustern zeigen. Zu den angezeigten Reporterlinien gehören Tg(nkx2.2a:memGFP) (b), Tg(myl7:EGFP) (c) und Tg(phox2b:EGFP) (d). (e) Das Bild zeigt das Glowscope im Einsatz für die Betrachtung grüner Fluoreszenz. (f–g) Diagramme zeigen die Emissionswellenlänge der blauen LED-Taschenlampe (schwarze und blaue Linien, gemessen mit einem Vernier-Spektrometer) im Vergleich zum Anregungsprofil von EGFP (grau, erhalten von www.fpbase.org). Der gestrichelte Kastenbereich in Bild (f) wird in Bild g weiter vergrößert, um die Wirkung des R4990-Filters detaillierter darzustellen. Die Bilder in den Panels (b–d) wurden mit einem Apple iPhone XR aufgenommen.

Die Bühnenbeleuchtungsfilter Nr. 14 und Nr. 312 von Rosco blockierten effektiv blaues Licht und ermöglichten gleichzeitig die Übertragung eines robusten grünen Fluoreszenzsignals zur Kamera (Abb. 2a). Um die Funktionalität dieses Aufbaus zu testen, verwendeten wir transgene Zebrafisch-Reporterlinien, die verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) in Untergruppen von Geweben oder Nervenzellen exprimierten. Beispielsweise konnte der Fluoreszenzaufbau problemlos die Fluoreszenz von Gehirn und Rückenmark in Tg(nkx2.2a:memGFP)-Embryonen und Herzgewebe in Tg(myl7:EGFP)-Embryonen nachweisen und verfügte über eine ausreichende Empfindlichkeit, um EGFP zu erkennen, das in einer Unterregion des Embryos exprimiert wurde embryonales Hinterhirn in Tg(phox2b:EGFP)-Embryonen (Abb. 2b – d). Um die Hintergrundfluoreszenz weiter zu reduzieren und das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, haben wir den Rosco-Filter 4990 zwischen der blauen LED-Taschenlampe und der Probe positioniert (Abb. 2a). Anekdotischerweise verdunkelte dieser „Anregungs“-Filter den ansonsten blaugrünen Hintergrund mit vernachlässigbarem Verlust an grüner Fluoreszenz, die emittiert und an die Smartphone-Kamera und das betrachtete Bild übertragen wurde. Mithilfe eines Vernier-Spektrometers stellten wir fest, dass der hinzugefügte Anregungsfilter die Intensität der LED-Fluoreszenz zwischen 460 und 500 nm leicht verringerte (Abb. 2f–g). Dies könnte die verringerte blaue Hintergrundfluoreszenz auf den betrachteten Bildern erklären, wenn der Anregungsfilter R4990 verwendet wurde. Obwohl dieser zusätzliche Anregungsfilter für die Betrachtung grüner Fluoreszenz nicht erforderlich ist, kann er den Hintergrund effektiv reduzieren und das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern, wenn Proben mit schwacher Fluoreszenz betrachtet werden. Um das Profil des blauen LED-Scheinwerfers weiter zu beurteilen, haben wir die Stromaufnahme bei 2,5 A und die Lichtintensität bei 492 Lux gemessen. Diese Messungen liegen innerhalb des Bereichs, der die Vermeidung einer längeren und direkten Augenexposition rechtfertigt (siehe „Diskussion“).

Wir haben auch LEDs und Bühnenbeleuchtungsfilter zur Betrachtung roter Fluoreszenz getestet (Abb. 3). Anstelle einer blauen Taschenlampe haben wir stattdessen eine grüne LED-Taschenlampe verwendet. Als unter dem Objektiv positionierter Emissionsfilter verwendeten wir den Rosco-Bühnenbeleuchtungsfilter Nr. 19, um grünes Licht zu blockieren und gleichzeitig rote Fluoreszenz zum Kameraobjektiv durchzulassen (Abb. 3a). In unseren Händen funktionierte dieser Emissionsfilter am besten, wenn er verdoppelt wurde, und ermöglichte eine klare Fluoreszenzdarstellung transgener Zebrafischlinien, die rot fluoreszierende Proteine exprimierten. Beispielsweise beleuchtete dieser Aufbau effektiv die Gehirn- und Rückenmarksmerkmale von Tg(olig2:DsRed)-Embryonen, die Herzfluoreszenz in Tg(myl7:mCherry)-Embryonen und die Fluoreszenz des Kopf- und Kieferskeletts (kranielle Neuralleiste) in Tg(sox10:mRFP). Embryonen (Abb. 3b–d). Die von uns verwendete LED-Taschenlampe warb für eine 530-nm-LED-Anregung, die unter den von uns verwendeten Fluorophoren am besten mit den spektralen Eigenschaften von DsRed übereinstimmte. In unseren Händen passten die grünen Taschenlampen- und Rosco-Bühnenbeleuchtungsfilter tatsächlich am besten zu DsRed, etwas weniger gut jedoch zu den rotverschobenen fluoreszierenden Proteinen mRFP und mCherry (Abb. 3b – d). Hintergrundfluoreszenz und Signal-Rausch-Verhältnis wurden geringfügig verbessert, indem die Taschenlampe mit den Rosco-Filtern Nr. 88 und Nr. 89 abgedeckt wurde (Abb. 3a). Diese Anregungsfilterung verringerte die Fluoreszenzintensität bei Wellenlängen zwischen 540 und 580 nm (Abb. 3f – g) und erklärt möglicherweise die verringerte Hintergrundfluoreszenz, die in den aufgenommenen Bildern beobachtet wurde, als die Anregungsfilter verwendet wurden. Obwohl die Anregungsfilter Nr. 88 und Nr. 89 die Bildqualität und die Erkennung schwacher Fluoreszenz verbesserten, waren sie für die Bildgebung mit roter Fluoreszenz in unseren Händen nicht erforderlich.

Glowscope-Detektion rot fluoreszierender Proteine. (a) Schematische Darstellung der Komponenten, die für die Betrachtung der roten Fluoreszenz auf dem Glowscope verwendet werden. Im Vergleich zur Betrachtung mit grüner Fluoreszenz sind Taschenlampe und Filter geändert, der Rest des Glowscopes bleibt jedoch unverändert. (b–d) Repräsentative Fluoreszenzbilder transgener Zebrafischembryonen (3–4 dpf, Seitenansichten), die rote Fluoreszenz in zelltypspezifischen Mustern zeigen. Zu den angezeigten Reporterlinien gehören Tg(olig2:DsRed) (b), Tg(myl7:mCherry) (c) und Tg(sox10:mRFP) (d). Der Maßstabsbalken beträgt 1 mm. (e) Das Bild zeigt das Glowscope im Einsatz für die Betrachtung roter Fluoreszenz. (f–g) Diagramme zeigen die Emissionswellenlänge der grünen LED-Taschenlampe (schwarze und grüne Linien, gemessen mit einem Vernier-Spektrometer) im Vergleich zum Anregungsprofil von DsRed (grau, erhalten von www.fpbase.org). Der gestrichelte Kastenbereich in Bild (f) wird in Bild (g) weiter vergrößert, um die Wirkung der R88- und R89-Filter detaillierter darzustellen. Die Bilder in den Panels (b–c) wurden mit einem Apple iPhone XR aufgenommen und Panel (d) wurde mit einem iPhone 12 Pro aufgenommen.

Die Teile, die benötigt werden, um ein Smartphone oder Tablet in ein Fluoreszenzmikroskop umzuwandeln, sind in Abb. 4 zusammengefasst. Zum Zeitpunkt unserer Tests und Manuskripterstellung wurden die notwendigen Teile für insgesamt 30–50 USD pro einzelnes Glowscope erworben (Abb. 4a). ). Holz und Plexiglas wurden mit einfachen Werkzeugen geschnitten und gebohrt. Theaterbühnenbeleuchtungsfilter wurden in großen Bögen gekauft und auf Maß zugeschnitten, was zu Kosten von weniger als 0,10 USD pro Filtereinheit für diese Anwendung führte. Blaue und grüne LED-Taschenlampen waren bei Online-Händlern leicht erhältlich und wurden für taktische, Jagd- und Angelanwendungen verkauft. Wir haben zahlreiche Optionen getestet und festgestellt, dass diejenigen mit blauem statt UV-Licht am besten für die Betrachtung grün fluoreszierender Proteine geeignet sind. Unsere bevorzugte Lichtquelle war eine mehrfarbige taktische Taschenlampe mit den Farben Blau (454 nm) und Grün (530 nm), die zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Studien für 20 USD im Einzelhandel erhältlich war. Indem wir die Verkäufer direkt kontaktierten und in großen Mengen einkauften, arrangierten wir einen Direkteinkauf zum Großhandelspreis (~ 50 % Rabatt). Weitere Details zu Teilen und Bauanweisungen finden Sie in den ergänzenden Methoden.

Zusammenfassung der Glowscope-Komponenten und Smartphone-Kompatibilität. (a) Die Tabelle zeigt die Grundkomponenten und Kosten (zum Zeitpunkt dieser Studie) in US-Dollar. (b) Repräsentative Bilder von Tg(phox2b:EGFP)-Zebrafischembryonen zeigen die Kompatibilität mit allen getesteten Geräten, aber feine Unterschiede zwischen den verschiedenen zum Testen verwendeten Tablets und Smartphones. Der Maßstabsbalken beträgt 1 mm.

Um die Kompatibilität des Glowscopes mit verschiedenen Kamerageräten zu beurteilen, haben wir als Nächstes die Fluoreszenzanzeigefunktionen mit verschiedenen Smartphone- und Tablet-Modellen getestet, um grüne Fluoreszenz in Tg(phox2b:EGFP)-Embryonen zu erkennen. Von den ursprünglich getesteten grünen Reporterlinien (Abb. 2b – d) war Tg(phox2b:EGFP) am schwierigsten zu erkennen, da die grüne Fluoreszenzexpression nur in einem Teil des embryonalen Hinterhirns vorhanden ist. Alle getesteten Geräte, darunter Samsung-, Apple-, Google- und Motorola-Telefone und -Tablets, erkannten die subtile grüne Fluoreszenz im Hinterhirn (Abb. 4b). Neuere Geräte erfassten im Allgemeinen Fluoreszenzbilder mit helleren Grünintensitäten im Vergleich zur Hintergrundfluoreszenz, diese Unterschiede waren jedoch geringfügig. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Verwendung der neuesten Smartphone- oder Tablet-Modelle für die Fluoreszenzbetrachtung mit dem Glowscope nicht erforderlich ist.

Als nächstes testeten wir die Fähigkeit des Glowscopes, Veränderungen der Herzfrequenz und des Rhythmus mithilfe der Grünfluoreszenz-Bildgebung bei embryonalen Zebrafischen zu erkennen. Da der Tg(myl7:EGFP)-Reporter grüne Fluoreszenz in Kardiomyozyten ausdrückt, machten das Glowscope und die Live-Smartphone-Anzeige die schlagenden Herzkammerbewegungen über die Zeit deutlich beobachtbar (Abb. 5a). Um festzustellen, ob der Bildgebungsaufbau in der Lage war, medikamenteninduzierte Veränderungen der Herzfrequenz zu erkennen, führten wir vor und nach der 30-minütigen Behandlung mit Astemizol eine Vor- und Nachuntersuchung durch (Abb. 5b). Früher als Hismanal vermarktet, wurde Astemizol häufig als Antihistaminikum gegen Allergien eingesetzt, wurde jedoch 1999 vom Markt genommen, weil es seltene, aber tödliche Herzkomplikationen wie das lange QT-Syndrom, Herzrhythmusstörungen und lebensbedrohliche Tachykardie verursachte15. Diese Nebenwirkungen beim Menschen wurden verursacht, weil Astemizol zusätzlich zu seiner antihistaminischen Wirkungsweise K+-Kanäle vom ERG-Typ blockiert, die an der Repolarisierung des kardialen Aktionspotentials16 beteiligt sind. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Behandlung mit Astemizol bei Zebrafischembryonen eine dosis- und zeitabhängige Bradykardie, gefolgt von einem atrioventrikulären 2:1-Block (Arrhythmie) und einem Herzstillstand verursacht17. Mithilfe der Smartphone-Fluoreszenzbeobachtung von Tg(myl7:EGFP)-Zebrafischen in Echtzeit stellten wir nach 30-minütiger Behandlung mit Astemizol eine signifikante Verringerung der Herzfrequenz fest (Abb. 5b–c). Diese durch eine medikamentöse Behandlung verursachte Bradykardie wurde in ähnlicher Weise während der Videoaufzeichnung (Live-Ansicht), durch Betrachten des aufgezeichneten Videos bei der Wiedergabe auf dem Smartphone-Bildschirm oder durch Übertragen der Videoaufzeichnung zur Anzeige auf einem Laptop-Display beobachtet (Abb. 5d).

Glowscope-Erkennung von medikamenteninduzierten Veränderungen der Herzfrequenz in transgenen Zebrafischembryonen. (a) Das linke Fluoreszenzbild zeigt die GFP-Expression im Herzen eines Tg(myl7:EGFP)-Embryos (ventrale Ansicht). Der eingerahmte Bereich wird in der mittleren Spalte weiter vergrößert, die von oben nach unten die Kammerbewegungen in einem mit einem iPhone 11 Pro-Smartphone aufgenommenen Video zeigt. Um die Betrachtung der Kammerbewegungen zu erleichtern, wurden diese Videos auf einen Laptop übertragen, in ImageJ (kostenlose Software) geöffnet und mithilfe der Kantenerkennung verarbeitet, die die Wände der Kammern umreißt. Statische Pfeile heben die Bewegungen der Herzkammer hervor. (b) Flussdiagramm der Vor- und Nachabbildung der Zebrafisch-Herzfrequenz als Reaktion auf die Behandlung mit Astemizol (10 µM). (c) Diagramme zeigen die durchschnittliche Herzfrequenz von Zebrafischembryonen vor und nach der Behandlung mit Astemizol. n = 10 Tiere, gemessen in einem unabhängigen Experiment, P = 0,0002, gepaarter zweiseitiger t-Test. (d) Zusammenfassung der Messungen, die während der Videoaufzeichnung in Echtzeit durchgeführt wurden (linke Leiste), auf dem Smartphone nach der Videoaufzeichnung angezeigt wurden (mittlere Leiste) oder auf einem Laptop angezeigt wurden (rechte Leiste). N = 10 Tiere, gemessen in einem unabhängigen Experiment, P = 0,942, einfaktorielle ANOVA. Bei den Feldern (c–d) stellen die Streudiagrammpunkte die einzelnen Zebrafisch-(Herz-)Frequenzmessungen dar und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar.

Um die Möglichkeiten und Grenzen der Smartphone-Fluoreszenz weiter zu testen, haben wir als Nächstes die Möglichkeit untersucht, die Kontraktilitätsraten der Vorhof- und Ventrikelkammer getrennt aufzulösen, was unserer Einschätzung nach bei der Erkennung von Herzrhythmusstörungen hilfreich sein könnte. Auf den meisten von uns aufgenommenen Videoaufnahmen waren einzelne Kammerbewegungen bei einigen, aber nicht allen Embryonen deutlich sichtbar und führten zu einer Ausweitung der Grenzen des Glowscopes. Um die Klarheit und Erkennung von Kammerbewegungen zu verbessern, haben wir die Smartphone-Videos auf einen Computer übertragen, auf dem die frei verfügbare Software ImageJ (auch bekannt als Fiji) läuft. In Fidschi bot der Befehl „Kanten finden“ eine einfache Möglichkeit, die Ränder der Herzkammern und ihre Bewegungen im Zeitverlauf zu skizzieren (Abb. 6a–c). Durch die Überwachung der Fluoreszenzintensitätsänderungen speziell innerhalb eines kleinen ROI-Felds (Region of Interest) konnten wir im Laufe der Zeit oszillierende Bewegungen der Herzkammerwand in und aus dem ROI feststellen (Abb. 6c – d). Diese Methode ermöglichte eine klare Trennung der atrialen und ventrikulären Kontraktilitätsraten mithilfe des Smartphone-Geräts (Abb. 6c–d). Diagramme, die aus Videos erstellt wurden, die vor und nach der Behandlung mit Astemizol aufgezeichnet wurden, zeigten deutliche Unterschiede. Vor der Behandlung schlagen beide Kammern schnell und abwechselnd. Im Vergleich dazu verursachte eine 30-minütige Behandlung mit einer hohen Dosis Astemizol (30 µM) eine schwere Bradykardie und Arrhythmie, was durch die Blockierung des Ventrikels bei jedem zweiten Vorhofschlag sichtbar wurde (Abb. 6d).

Glowscope-Erkennung medikamenteninduzierter Herzrhythmusstörungen. (a–b) Standbilder aus einem Glowscope-Video (aufgenommen auf einem iPhone 11 Pro) zeigen Atrium- und Ventrikelkammern in einem 3 dpf Tg(myl7:EGFP)-Zebrafischembryo. Die Bilder zeigen entweder die rohe (unbearbeitete) Ansicht der Herzfluoreszenz direkt aus einer Smartphone-Videoaufzeichnung (a) oder eine verarbeitete Ansicht desselben Herzens nach der Kantenerkennung auf einem Computer mit Fidschi (b). Blaue und magentafarbene Rechtecke zeigen die Bereiche der Ventrikel- und Atriumkammern, die in (c–d) für die Betrachtung und Analyse mit hoher Vergrößerung verwendet werden. (c) Die Bilder zeigen einen Zeitverlauf (von oben nach unten) der Kammerbewegungen des Ventrikels (links) oder des Atriums (rechts), die vom Glowscope erfasst wurden (entsprechend den eingerahmten Regionen in Bild b). Die kleinen, gestrichelten Bereiche von Interesse wurden verwendet, um Änderungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit zu überwachen. Sternchen markieren Bilder, bei denen sich die Herzkammerwand im Vergleich zum vorherigen Bild in den interessierenden Bereich bewegt hat. (d) Diagramme der Fluoreszenzintensität gegenüber der Zeit, aufgetragen für die Atrium- und Ventrikelkammer, zeigen oszillierende Kammerbewegungen. Messungen innerhalb desselben Embryos (N = 1) wurden vor (oben) und nach der Behandlung mit Astemizol (unten) getrennt erfasst und analysiert. Die maximale Fluoreszenzintensität (in willkürlichen Einheiten) innerhalb des in Tafel (c) gezeigten gestrichelten Interessenbereichs wurde für jeden Zeitrahmen der Videoaufzeichnung ermittelt und grafisch dargestellt, was jedes Mal zu einem Fluoreszenzpeak führte, wenn die Kammerfluoreszenz in die Kammer eindrang und diese besetzte umrahmter Bereich von Interesse. Beachten Sie die Unterschiede in der Herzfrequenz zwischen Kontroll- und Astemizol-behandelten Herzen sowie das arrhythmische 2:1 atriale:ventrikuläre Schlagmuster, das durch die Astemizol-Behandlung induziert wird (unteres Diagramm, 30 µM). Blaue Pfeile in Bild (d) zeigen verpasste ventrikuläre Schläge. Videos verfügbar im Zusatzvideo S1.

Zusätzlich zu seiner Verwendung für die Fluoreszenzmikroskopie können der Glowscope-Rahmen und die aufsteckbare Linse auch für die Betrachtung nicht fluoreszierender Proben nützlich sein und werden in einigen wissenschaftlichen Outreach-Einrichtungen häufig verwendet3,4. In unseren Händen funktionierte eine unter der Probe positionierte LED-Arbeitslampe gut für transparente Proben wie Zebrafischembryonen und -larven (Abb. 1, 2, ergänzende Abb. S2). Da wir uns darüber im Klaren sind, dass Durchlicht für die Betrachtung nicht transparenter Proben möglicherweise unwirksam ist, haben wir als Nächstes alternative Beleuchtungsoptionen sowohl für transparente als auch für nicht transparente Proben verglichen. Bei der Betrachtung von Exemplaren wie Kaulquappen oder Insekten stellten wir fest, dass die Positionierung des Lichts neben oder über dem Exemplar (Epi-Beleuchtung) von Vorteil war (ergänzende Abbildung S2). Beide Optionen können erreicht werden, indem die LED-Arbeitsleuchte mit der Hand an der gewünschten Position gehalten wird. Als bequemere Option für die Epi-Beleuchtung haben wir USB-betriebene COB-LED-Streifenlichter umfunktioniert (siehe ergänzende Methoden). Diese preiswerten Leuchten werden normalerweise für die Beleuchtung von Haushaltsschränken und -schränken verkauft und verfügen über eine selbstklebende Rückseite (Klebeband), die es uns ermöglichte, sie direkt auf der Probe unter dem Plexiglas anzubringen (ergänzende Abbildung S2). Diese alternativen Beleuchtungsoptionen können nützlich sein, wenn Vielseitigkeit beim Probentyp gewünscht ist, waren aber für unsere Betrachtung von Zebrafischembryonen und -larven nicht notwendig.

Glowscopes mögen für einige Forschungsanwendungen geeignet sein, aber unser Hauptmotiv für ihre Entwicklung war es, den Bedürfnissen von Naturwissenschaftspädagogen und Outreach-Programmen gerecht zu werden. In den Vereinigten Staaten sehen die Empfehlungen für die Ausbildung in den Biowissenschaften auf der K-12- und Grundstufenebene die Steigerung des praxisorientierten, aktiven Lernens vor18. In diesen Empfehlungen wird die vorlesungsbasierte Informationsvermittlung als alleiniges Mittel zum Lernen der Studierenden herabgesetzt und stattdessen vorgeschlagen, dass die Studierenden Naturwissenschaften erlernen, indem sie die wissenschaftliche Methode iterativ selbst anwenden. Eine inhärente Herausforderung dieses pädagogischen Wandels ist der erhöhte Druck auf Lehrer, neue praktische Lernaktivitäten zu entwickeln, die ansprechend sind und die disziplinbasierten Lernziele unterstützen. Das Glowscope ist möglicherweise eines von vielen Werkzeugen, das preisgünstig ist, Schüler interessiert und begeistert und das praktische Lernen im Klassenzimmer unterstützen kann. Zur Unterstützung dieser Option stehen auf einem auf YouTube gehosteten Glowscopes-Kanal unter https://www.youtube.com/channel/UCoRglCdvrtqwkBcvP10ibDg Videos zur Dokumentation der Verwendung und Montageanleitungen zur Verfügung.

Um mögliche Einsatzmöglichkeiten zu bewerten, haben wir zunächst die K-12 Next Generation Science Standards (NGSS) untersucht. Wir haben disziplinäre NGSS-Kernideen identifiziert, die mit der Verwendung von Glowscope in den Klassenstufen 1, 3, MS (Mittelschule, Klassen 6–8) und HS (Oberschule, Klassen 9–12) kompatibel sind, und eine Tabelle mit vorgeschlagenen Lernaktivitäten für Schüler entwickelt jede dieser Ebenen (Ergänzungstabellen S1–S3). Die in diesen Tabellen vorgeschlagenen Lernaktivitäten für Schüler stützen sich auf unterschiedliche Weise auf Glowscopes. Bei manchen Aktivitäten kommt beispielsweise Fluoreszenz zum Einsatz, während bei anderen nicht-fluoreszierendes Betrachten zum Einsatz kommt. Der anfängliche Einsatz von Glowscopes ohne Fluoreszenz bereitet den Benutzer möglicherweise besser auf den späteren Einsatz von Fluoreszenzleuchten vor, der technisch anspruchsvoller ist. Bei vielen Aktivitäten wird die Verwendung von Zebrafischembryos vorgeschlagen, es können jedoch auch andere Organismen verwendet werden, unabhängig davon, ob sie vor Ort gesammelt oder von biologischen Lieferanten gekauft werden. Wenn die Verwendung von Zebrafischembryonen erwünscht ist, sollten Pädagogen www.zfin.org als Möglichkeit zur Suche nach nahe gelegenen Forschungslaboren kennen, die in ihrer Gegend bereits Zebrafische verwenden, was eine Möglichkeit für den lokalen Zugang zur Gewinnung von Embryonen oder zur Unterbringung erwachsener Tiere bieten könnte.

Als nächstes führten wir eine Reihe von Pilotexperimenten durch, um repräsentative Beispiele für NGSS-kompatible Lernaktivitäten für Schüler für die MINT-Ausbildung oder Öffentlichkeitsarbeit bereitzustellen. In der 1. Klasse empfiehlt NGSS den Pädagogen, die Schüler in Beobachtungen einzubeziehen und ihnen klassengerechte Kenntnisse in der Analyse und Interpretation von Daten zu vermitteln. Wir haben uns zunächst auf die spezifischen Kernideen konzentriert, die sich damit befassen, wie sich das Aussehen von Nachkommen derselben Eltern unterscheiden kann, und auf die Verhaltensweisen, die den Nachkommen zum Überleben verhelfen (ergänzende Abbildung S3). In diesen Beispielen verwenden die Schüler nicht fluoreszierende Glowscopes, um Tiere auf einem Smartphone- oder Tablet-Display zu betrachten und entwickeln Tabellen, um ihre Beobachtungen aufzuzeichnen. Um herauszufinden, wie das Verhalten der Nachkommen ihnen zum Überleben verhilft, haben wir die Embryonen mit einem Bleistift sanft berührt, ihre Reaktion beobachtet und Tabellen für Beobachtungen und die an diesen beobachteten Reaktionen beteiligten Körperteile erstellt. Obwohl diese Aktivität für Kaulquappen und Monarchraupen gezeigt wird (ergänzende Abbildung S3), wäre sie mit Zebrafischen oder vielen lokal gesammelten Insekten oder Würmern kompatibel. Lehrer sollten nach eigenem Ermessen entscheiden, ob die manuelle Geschicklichkeit so gut entwickelt ist, dass Schüler vermeiden können, den Proben unnötigen Schaden zuzufügen.

Eine weitere Frage, die in den Kernideen der Klasse 1 behandelt wird, ist, wie Tiere die für das Wachstum benötigten Informationen erfassen und auf eine Weise reagieren, die ihnen zum Überleben verhilft (Abb. 7a). Zebrafische erlangen zunächst in der ersten Lebenswoche die Fähigkeit, Nahrung visuell zu beobachten, sich bewegende Nahrung (Beute) aufzuspüren und anzugreifen und mit dem Kiefer Nahrung zu fressen19,20. Paramecia sind eine häufig genutzte Nahrungsquelle für junge Zebrafische. Diese einzelligen Organismen „schwimmen“ im Wasser und nutzen Flimmerhärchen, um ihre Bewegungen voranzutreiben. Individuen können bis zu 0,5 mm lang sein und sind mit bloßem Auge schwer zu erkennen, ihre Bewegungen in Petrischalen mit Zebrafischlarven konnten jedoch leicht mit einem Smartphone mit aufsteckbarer Linse beobachtet werden (Abb. 7b). Die Zugabe von Paramecia zur Petrischale mit Zebrafischen erhöhte die Häufigkeit von Schwimmereignissen (Abb. 7c – e). Wir schlagen vor, dass die Schüler nicht gefütterte mit gefütterten Petrischalen (die Paramecia enthalten) vergleichen und die Verhaltensweisen und Körperteile beobachten, die verwendet werden, um auf das Vorhandensein von Paramecia zu reagieren (Abb. 7f). Diese Reaktionen sind für Wachstum und Überleben unerlässlich und umfassen mehrere Organismussysteme.

Lernaktivität für Schüler der 1. Klasse, die sich mit den NGSS-Kernideen über die zum Überleben benötigten Tierkörperteile befasst. (a) Beschreibung des NGSS-Standards und der vorgeschlagenen Studentenaktivität. (b) Der Zeitverlauf (links, graue Bildserie) zeigt zwei bewegliche Paramecia (blaue und schwarze Pfeile) im selben Sichtfeld wie eine gelähmte Zebrafischlarve (dargestellt zum Maßstabsvergleich). Das Farbbild rechts ist eine Zeitprojektion mit maximaler Intensität, die das hellste Pixel aus jedem Bild in einem Zeitraffervideo darstellt und dadurch die Flugbahn jedes Parameciums (grün) markiert. Diesem Bild wurde mithilfe der Texturierungsfunktion in PowerPoint Farbe hinzugefügt. (c) Entwurf einer Lernaktivität für Schüler, bei der das Schwimm- und Beuteverfolgungsverhalten zwischen einer Schüssel mit Zebrafischlarven ohne Nahrung (Gleitbarttierchen) und Geschwistern in Anwesenheit von Gleittierchen verglichen wird. (d) Die Zeitverlaufsbildserie zeigt Zebrafischlarven in Abwesenheit oder Anwesenheit von Paramecia in der Petrischale. Beachten Sie den relativen Mangel an Bewegung bei den Kontrollen (oben, Schale 1) im Vergleich zur mit Paramecia behandelten Schale (unten, Schale 2). Der in (d) dargestellte Zeitverlauf beträgt 33 ms. (e) Die Grafik zeigt den Unterschied in der Häufigkeit des Schwimmverhaltens von Fischlarven (5 dpf) zwischen den in (d) vorgeschlagenen Gruppen. N = 4 Larven pro Bedingung, erhalten in einem unabhängigen Experiment; Balken zeigen den Mittelwert ± Standardfehler; P = 0,0911, gepaarter zweiseitiger t-Test. (f) Beispiel für Schülerbeobachtungen, bei denen Gruppen aus Panel (d) verglichen werden und die Körperteile vorgeschlagen werden, die am Beuteverfolgungsverhalten beteiligt sind. Die Bilder wurden mit einem Apple iPhone 12 Pro mit (b) und ohne (d) aufsteckbarem Makroobjektiv aufgenommen.

In den Biowissenschaften der Oberstufe (Klasse 9–12) konzentrieren sich die Kernideen von NGSS auf Gene, Vererbungsmechanismen und den Einfluss von Genen und Umwelt auf die Darstellung von Merkmalen. Um den Einfluss der Umgebung auf die Darstellung von Merkmalen zu untersuchen, haben wir eine Möglichkeit entwickelt, mithilfe von Glowscopes Veränderungen zu überwachen, die durch Temperatur und Wassersäuregehalt hervorgerufen werden. In diesen Lernaktivitäten können Schüler untersuchen, wie einzelne Zebrafische als Reaktion auf diese Umweltreize Veränderungen der embryonalen Herzfrequenz zeigen (ergänzende Abbildung S4). Wir demonstrieren einfache Aktivitäten, bei denen die Herzfrequenz vor und nach 10-minütiger Platzierung auf einer 35 °C warmen Reptilienunterlage verglichen wird (ergänzende Abbildung S4). Fische können auch Veränderungen in ihrer Umgebung in Form von Wasserübersäuerung erfahren. Um dies zu modellieren, fügten wir dem Wasser Haushaltsessig hinzu und beobachteten eine verringerte Herzfrequenz nach 25-minütigem Eintauchen in saures Wasser (ergänzende Abbildung S4).

Neben der Beobachtung von Merkmalen und ihrer Abhängigkeit von Genetik und Umwelt betonen die Kernideen von NGSS auch Mechanismen der genetischen Vererbung auf der Oberstufenebene (Abb. 8a). Da Transgene dominante Merkmale sind und nach Mendelschen Mustern vererbt werden, kann die Verwendung der „Leuchtmerkmale“ von Zebrafischen eine unterhaltsame und nützliche Möglichkeit für Schüler sein, Punnett-Quadrate zu lernen. Bei dieser Lernaktivität werden den Schülern mehrere Petrischalen zur Verfügung gestellt, die jeweils Embryonen aus verschiedenen Elternkreuzungen enthalten (Abb. 8b). Zunächst beobachten die Schüler jedes Gericht und den Anteil der Nachkommen, die das „Glanzmerkmal“ aufweisen. Anschließend entwickeln die Schüler Punnett-Quadrate für alle möglichen elterlichen Genotypen, heben hervor, welche Nachkommen-Genotypen dominante Phänotypen aufweisen, und gleichen dann ihre beobachteten Daten einem oder mehreren Punnett-Quadraten zu. Anschließend können die Schüler ihre Modelle verwenden, um die möglichen elterlichen Genotypen für jedes Gericht der Nachkommen zu bewerten und zu diskutieren.

Die Lernaktivität der NGSS-Schüler der Klassen 9–12 konzentrierte sich auf Genetik und Vererbung. (a) Beschreibung des NGSS-Standards und der vorgeschlagenen Studentenaktivität. (b) Repräsentative Glowscope-Fluoreszenzbilder von Zebrafischlarven mit 4 dpf Tg(myl7:EGFP), die zur Bestimmung des Anteils verwendet wurden, der das grüne Herzmerkmal erbt (angezeigt durch weiße Pfeile). Tabellierte Daten, die jeweils aus einem einzelnen Gelege von Zebrafischembryonen stammen, werden mit Punnett-Quadraten abgeglichen, die mit den beobachteten phänotypischen Verhältnissen der Nachkommen übereinstimmen. Die Bilder wurden mit einem Apple iPhone 12 Pro aufgenommen.

In dieser Studie haben wir Komponenten entwickelt und charakterisiert, um ein Smartphone oder Tablet zu einem Preis von 50 US-Dollar oder weniger pro Einheit in ein minderwertiges Fluoreszenzmikroskop umzuwandeln. Diese selbstgebauten Geräte, die wir als Glowscopes bezeichnen, sind in der Lage, grüne und rote Fluorophore mit einer Auflösung von bis zu 10 µm abzubilden und nutzen die hohen Bildratenfähigkeiten von Smartphone-Kameras für Videoaufnahmen. Der größte Fortschritt dieser Studie ist die Entwicklung der Betrachtung grüner und roter Fluoreszenz mithilfe kostengünstiger LED-Taschenlampen für den Freizeitgebrauch und Filtern für Theaterbühnenbeleuchtung, die mit anderen Mikroskopdesigns als dem Smartphone und dem Aufsteckobjektiv, das wir verwendet haben, kompatibel sein sollten unsere Studie. Aufgrund der geringen Kosten sollte das spezifische Design, das wir in dieser Studie charakterisieren und berichten, es ermöglichen, ganze Klassenzimmer mit mehreren Glowscopes auszustatten und so den Schülern mehr Zeit für die praktische Arbeit an Experimenten zu geben. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass Glowscopes für einige Forschungsanwendungen nützlich sein könnten, die keine hohe Vergrößerung erfordern und hell fluoreszierende Proben enthalten. Dadurch können Labore beispielsweise gleichzeitig Videodaten von vielen Glowscopes erfassen, was für Labore, die keinen Zugang zu mehreren Fluoreszenzmikroskopen haben, möglicherweise nicht möglich ist.

In Kombination mit anderen kostengünstigen oder DIY-Smartphone-Mikroskopen wie Foldscopes können Labore oder Schüler in Klassenzimmern eine Reihe mikroskopischer Bilder mit Tablets und Smartphones erstellen. Insbesondere können Foldscopes eine mindestens fünfmal größere Vergrößerung (mehr als 2 µm Auflösung) als die von uns getestete Glowscope-Konfiguration erreichen, was Foldscopes zu leistungsstarken Geräten für die nicht fluoreszierende Smartphone-Bildgebung macht2. Diese zusätzliche Auflösung bringt Kompromisse mit sich, die durch Glowscopes ergänzt werden können. Zusätzlich zu den Unterschieden in der Fluoreszenzfähigkeit hat die zusätzliche Vergrößerung des Foldscope den Nachteil, dass die Arbeitsabstände verringert werden, was die Arbeit mit Wasserorganismen oder Proben in Petrischalen schwierig oder unmöglich machen kann. Im Vergleich dazu verfügt das in dieser Studie verwendete Glowscope-Aufsteckobjektiv über längere und flexiblere Brennweiten, wodurch es mit großen Proben und der Verwendung von Petrischalen kompatibel ist und mit oder ohne Aufsteckobjektiv für nicht fluoreszierende Betrachtungen verwendet werden kann Makro-Objektiv. Bei Verwendung ohne Aufsteckobjektiv liegt die Brennweite zwischen Smartphone und Probe in der Größenordnung von 5–10 cm. Auf diese Weise kann der Glowscope-Rahmen mit Smartphone-Kamera als einfaches Präpariermikroskop dienen.

Das Glowscope ist mittlerweile eine von mehreren Möglichkeiten, Fluoreszenzmikroskopie mit einem Smartphone-Mikroskop durchzuführen. Verschiedene Methoden und Aufsätze zur Fluoreszenzbetrachtung mit einem Smartphone haben jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile, abhängig von der vom Benutzer gewünschten Anwendung. Optionen bestehen beispielsweise, wenn die Probe mit einem Objektträger kompatibel ist, der in ein 3D-gedrucktes Gerät eingesetzt werden kann, das am Smartphone befestigt wird21,22,23. Diese Ansätze bieten möglicherweise eine größere Vergrößerung und Auflösung als das bei Glowscopes verwendete aufsteckbare Makroobjektiv. Ein Nachteil besteht darin, dass 3D-gedruckte Aufsätze möglicherweise nur mit bestimmten Smartphone-Modellen funktionieren. Die Einschränkung beim Einsetzen von Objektträgern schränkt auch den Arbeitsabstand, die Sezierfähigkeit und die Kompatibilität mit Proben wie lebenden Kaulquappen oder Zebrafischembryonen ein, die in Wasser eingetaucht werden müssen. Eine weitere Methode besteht darin, das Objektiv des Telefons dauerhaft zu wechseln, indem die Filter direkt an das Objektiv angeschlossen werden24. Dieser Ansatz funktioniert möglicherweise in einer Forschungsumgebung, in der ein Smartphone-Gerät für diesen Zweck reserviert werden kann, ist jedoch keine gute Option, wenn die schul- oder schülereigenen Geräte für andere Zwecke verwendet werden und nicht dauerhaft geändert werden können.

Unsere Tests in dieser Studie wurden mit Zebrafischembryonen und -larven durchgeführt, aber das Smartphone-Mikroskop ist nicht nur mit Zebrafischen kompatibel. Wenn jedoch die Verwendung von Glowscopes im K-12-Bereich oder im Grundstudium erwünscht ist, sind Zebrafisch-Aquarien und Forschungsgruppen mittlerweile an den meisten Hochschulen und Universitäten üblich und können mithilfe der ZFIN-Website gefunden werden, um nach Community-Mitgliedern (Personen) anhand des Standorts (Adresse; Adresse) zu suchen. Stadtname). Dadurch ist der Erwerb von Zebrafischembryonen in den meisten Großstädten möglich. Es gibt bereits viele MINT-Outreach-Programme, die lokalen Pädagogen Zebrafische zur Verfügung stellen und in einigen Fällen Pädagogen ausbilden25,26,27. Darüber hinaus könnten Pädagogen mit minimaler Anleitung und Ausrüstung ausgewachsene GloFish bei örtlichen Einzelhändlern oder online kaufen, Fischzuchten in kleinen Becken durchführen und so oft wie gewünscht ihre eigenen Embryonen erwerben. Es gibt viele transgene Reporterlinien, die rote und grüne Fluorophore in verschiedenen Zell- und Gewebetypen exprimieren und über Ressourcenzentren oder durch direkte Kontaktaufnahme mit Laboren erhältlich sind. Basierend auf unseren Beobachtungen wäre jede transgene Linie, die EGFP oder rote Fluorophore exprimiert, mit Glowscopes kompatibel. Die Auswahl derjenigen mit einer helleren fluoreszierenden Reporterexpression, einer breiteren Expression (mehr Zellen und Gewebe) und mit fluoreszierenden Proteinen, die der Wellenlänge der Taschenlampen-LED am nächsten kommen, wäre von Vorteil. Beispielsweise funktionierten die von uns getesteten Freizeit-LED-Taschenlampen mit ~ 450 nm und 530 nm am besten mit EGFP bzw. DsRed.

Empfehlungen für den naturwissenschaftlichen Unterricht und eine evidenzbasierte Pädagogik haben sich von der traditionellen Vorlesungsmethode und dem Auswendiglernen von Informationen durch den Lernenden entfernt. Lehr- und Lernstudien deuten vielmehr darauf hin, dass aktiveres und forschendes Lernen die Schüler einbezieht und zu besseren Lernergebnissen führt28. Studierenden die Möglichkeit zu geben, ihre eigenen Beobachtungen zu machen, Modelle und Vorhersagen zu bilden, Daten zu erfassen und zu interpretieren und diese zur Überarbeitung ihrer Modelle und ihres Verständnisses zu nutzen, sind häufige Erkenntnisse aus dem Studium der Life-Science-Pädagogik sowie den Empfehlungen von NGSS und Vision and Change in Biology Undergraduate Education15 ,29. Der Einsatz von Geräten wie Glowscopes und Foldscopes kann diese Ziele unterstützen und es Schülern ermöglichen, etwas über Naturwissenschaften zu lernen, indem sie Naturwissenschaften betreiben. Auf diese Weise bauen die Studierenden ihr eigenes Verständnis der Konzepte auf, anstatt zu versuchen, die im Vorlesungsformat vermittelten Informationen zu absorbieren.

Unsere Studie stützte sich hauptsächlich auf Zebrafische für Lernaktivitäten im naturwissenschaftlichen Unterricht. Leuchtende transgene Zebrafischembryonen oder -larven bieten Schülern die Möglichkeit, grundlegende Prinzipien wie Gene und Proteine, Vererbung, Physiologie, Tierverhalten, Lebenszyklen und die Entwicklung von Organismen zu erforschen. Darüber hinaus kann der Zebrafisch auch ein nützliches Instrument sein, um Wechselwirkungen zwischen Organismen und der Umwelt zu untersuchen, da sich Faktoren leicht zum Embryowasser in der Petrischale hinzufügen lassen. Beispielsweise wird die Struktur und Funktion des Zebrafischherzens, die im Glowscope leicht sichtbar ist, durch Herbizide, Pestizide, Fungizide, Alkohol und Tabak beeinflusst30,31,32,33,34. Diese und andere in den Ergänzungstabellen S1–S3 aufgeführten Empfehlungen können eine Grundlage dafür bilden, wie Pädagogen Glowscopes verwenden können, um Lernende jeden Alters zu begeistern, Lernaktivitäten mit den Kernideen der NGSS-Disziplinen in Einklang zu bringen und sich mit NGSS-Wissenschafts- und Ingenieurpraktiken auseinanderzusetzen. Es ist erwähnenswert, dass Glowscopes oder ähnliche Geräte für nichtbiologische Aktivitäten wie Geowissenschaften, Kunst, Optik, Elektronik oder Informatik nützlich sein könnten. Beispielsweise kann Software wie ij.imjoy.io auf Mobiltelefonen verwendet werden, um die Kamera direkt zu steuern, was erweiterte Funktionen bieten würde und dazu dienen könnte, den Schülern den Umgang mit grundlegender Codierung und Makros beizubringen35.

Eine mögliche Einschränkung bei der Integration von Glowscopes in K-12-Klassenzimmern ist die Zugänglichkeit der Geräte. Unsere Tests zeigen, dass Glowscopes mit Apple-, Samsung-, Google- und Motorola-Geräten kompatibel sind. Im Durchschnitt machen diese Geräte etwa 95 % der auf dem US-amerikanischen Markt verwendeten Geräte aus36,37,38. Obwohl wir noch keine Tests mit anderen Geräten wie LG oder Huawei durchgeführt haben, gehen wir aufgrund der universellen Kompatibilität mit den von uns getesteten Geräten davon aus, dass diese ähnlich funktionieren würden. Schülern in einigen K-12-Klassenzimmern ist die Nutzung persönlicher Geräte möglicherweise nicht gestattet. Allerdings stellen alle von uns kontaktierten Schulbezirke (N = 4) entweder Apple iPads an Schüler aus oder verfügen über Flotten von Geräten, die bei Bedarf in die Klassenzimmer gebracht werden können. Eine zweite Einschränkung oder Herausforderung im Zusammenhang mit Glowscopes ist die konsistente Beschaffung von Linsen und blauen LED-Taschenlampen. Der stationäre Einzelhandel führt in der Regel keine oder nur zeitweise blaue LEDs oder Smartphone-Linsenadapter, die für diese Anwendung geeignet sind. Wir kauften daher Teile bei Online-Händlern, stellten jedoch fest, dass spezifische Teilenummern häufig nicht angegeben sind und sich die Produktverfügbarkeit häufig ändern kann. Detaillierte Teileinformationen in den ergänzenden Methoden können verwendet werden, um potenzielle Probleme bei der Beschaffung von LEDs und Aufstecklinsen zu lösen. Eine einfache Lösung hierfür könnte die mehrfarbige LED-Taschenlampe (Lumenshooter) sein, die wir für die Betrachtung der roten Fluoreszenz verwendet haben und die mit ihrer Einstellung für blaues Licht auch für die Betrachtung der grünen Fluoreszenz gut funktioniert. Dieses Produkt wurde während unserer gesamten Recherche- und Manuskriptvorbereitungsphase weiterhin von Amazon auf Lager gehalten. Eine breite Palette anderer Produkte als die, die wir in dieser Studie auflisten, dürften für diese Anwendung geeignet sein, vor der Skalierung sind jedoch möglicherweise einige erste Tests erforderlich. Blaue oder königsblaue (~ 450 nm) LEDs funktionieren optimaler bei der Anregung grüner Fluorophore als violett-blaue Lichter mit stärkerer UV-Verschiebung (z. B. 405 nm), die häufiger im stationären Einzelhandel verkauft werden. Wenn ein Benutzer Schwierigkeiten hat, herauszufinden, welche Lichtquellen am besten geeignet sind, und praktische Tests mit der gewünschten Probe nicht durchführbar sind, sollte die Kontaktaufnahme mit einer örtlichen Universitätsphysikabteilung einen einfachen Zugang zu einem Spektrometer ermöglichen, mit dem Wellenlängen mit minimalem Zeit- und Arbeitsaufwand getestet werden können.

Eine weitere Einschränkung oder ein weiterer Nachteil besteht in der Verwendung blauer LEDs, die potenziell gefährlich sein könnten, wenn Schüler das Licht auf unbeabsichtigte Weise in ihre Augen richten würden39. Die in unseren Studien verwendete blaue LED-Stirnlampe zeigte Stromaufnahme und Lichtintensitäten in dem Bereich, der als „Stellt keine Gefahr aufgrund der Abneigung gegen helles Licht oder thermische Unannehmlichkeiten dar“ (RG-2) gemäß der Definition in den IEC 62471-Richtlinien auf photobiologische Sicherheit von Lampen und Lampensystemen40. Diese blaue LED war ausreichend, aber nicht zu stark, um grüne Fluoreszenz in Embryonen zu erkennen. Daher ist es wahrscheinlich, dass blaues LED-Licht, das für die Fluoreszenzanzeige auf dem Smartphone verwendet wird, mit einiger Vorsicht verwendet werden sollte. Eine Lösung wäre, die LED-Leuchte auf einem Stativ zu montieren, was die versehentliche und nicht versehentliche Augenexposition reduzieren und außerdem das Licht für eine bessere Datenerfassung stabilisieren würde. Basierend auf unseren Gesprächen mit mehreren Lehrern, Administratoren und Spezialisten für den naturwissenschaftlichen Unterricht sind LED-Leuchten in naturwissenschaftlichen Grundschulklassen, einschließlich der 3. Klasse und höher, bereits üblich. Pädagogen sollten sich darüber im Klaren sein, dass blaue Wellenlängen schädlicher sein können als weiße oder andersfarbige Taschenlampen und dass Laserpointer möglicherweise ein noch größeres Sicherheitsrisiko darstellen als Taschenlampen. Wir raten zur Vorsicht und zur Diskretion der Lehrer bei der Verwendung von blauem Leuchtstofflicht in frühen Grundschulklassen. Der nicht fluoreszierende Einsatz von Glowscopes durch Schüler im frühen Grundschulunterricht kann sie mit der Smartphone-Mikroskopie vertraut machen und sie auf den fortgeschritteneren Fluoreszenzeinsatz mit denselben Geräten in späteren Klassenstufen vorbereiten. Dies würde mit einem angemessenen Alter zusammenfallen, in dem die Schüler verhaltensmäßig in der Lage sind, Sicherheitsrichtlinien zu befolgen.

Alle Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Erika Vail (Winona State University) für technische Unterstützung, Carl Ferkinhoff (Winona State University), Andrew Ferstl (Winona State University) für Ratschläge und Instrumentenaustausch und Amblynn Reisetter (Winona Public Schools) für hilfreiches Feedback. Diese Arbeit wurde durch den NSF CAREER Award IOS-1845603 (JHH) und den Winona State University Foundation Special Projects Award 251.0342 an Heather Nelson unterstützt.

Biologieabteilung, Winona State University, Winona, MN, USA

Madison A. Schaefer, Heather N. Nelson, John L. Butrum, James R. Gronseth und Jacob H. Hines

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JHH und HNN haben das Projekt konzipiert. MAS, JHH, JLB und JRG führten Experimente durch. JHH und MAS haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Jacob H. Hines.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schaefer, MA, Nelson, HN, Butrum, JL et al. Ein kostengünstiges Smartphone-Fluoreszenzmikroskop für Forschung, Life-Science-Ausbildung und MINT-Ausbildung. Sci Rep 13, 2722 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29182-y

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Eingegangen: 26. August 2022

Angenommen: 31. Januar 2023

Veröffentlicht: 09. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29182-y

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